抗gp130单克隆抗体B-R_(12),B-S_8和B-K_(11)的生物学特性研究

我们已研究5个抗如gp13O单克隆抗体的生物学特性,证明gp130分子上不同的位点涉及不同IL-6家族细胞因子的活动。本文继续研究另3个抗gp130单克隆抗体B－R12，B-S8和B-K11的生物学特性。结果显示，B-R12和B-S8可抑制IL-6家族细胞因子的活动；相反,B-K11IL-6家族细胞因子的活动无任何影响。

抗人IL-6Rβ(gp130)单克隆抗体对IL-6信号分子调控浅析

目的:分析鼠抗人IL-6Rβ(gp130)单克隆抗体[anti-IL-6Rβ(gp130)mAb]的生物学特性及对IL-6信号分子的调节作用。方法:利用Western blot、竞争性ELISA实验、功能表位结合实验,检测anti-IL-6Rβ(gp130)mAb的亲和力、效价及与gp130抗原表位结合特异性。进而探讨anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对U266细胞、RA患者外周血单个核细胞(PBMC)及滑膜液单个核细胞(SFMC)增殖和分化中的IL-6信号分子的调控机制。结果:Anti-IL-6Rβ(gp130)mAb对gp130具有高亲和性(如10A1细胞株的亲和力常数可达为2.62E-10),所获得的多株单抗还具有针对不同抗原结合表位的特性,可用于分析和研究IL-6信号通路及下游STAT3的磷酸化。结论:获得针对不同抗原结合表位的anti-IL-6Rβ(gp130)mAb,初步的实验结果表明此类单抗不仅具有调控IL-6信号分子和下游STAT3磷酸化的生物学功能,并为解析临床RA的发病与IL-6信号分子的关联性提供了初步的实验结果。

抗人gp130单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

目的:制备小鼠抗人IL-6Rβ(gp130)单克隆抗体,并分析其生物学特性及初步的免疫学功能。方法:用gp130抗原免疫BALB/c小鼠,经三次免疫获得高效价的ELISA结果后,取小鼠的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经多次亚克隆筛选得到稳定分泌抗gp130单克隆抗体的杂交瘤细胞株。大量扩增杂交瘤细胞,收集细胞上清,随即过亲合层析柱进行纯化,对经纯化的抗人gp130单克隆抗体进行亚型鉴定,用Western blot及间接ELISA、biacore方法分析抗人gp130单克隆抗体的纯度、特异性及亲和力,用FACS术检测抗人gp130单克隆抗体与膜表面富含IL-6受体的U266细胞系的结合率,同时建立IL-6诱导的U266细胞增殖系统,用以检测和分析抗人gp130单克隆抗体的抑制和阻断效应。结果:本研究获得了多株能够稳定分泌抗人gp130单克隆抗体的细胞株,取其中一株(14C4)进行分析,表明其亚型属于IgG2b,轻链为κ链,经Western blot及间接ELISA证明此株抗体有较高的纯度及特异性,biacore结果显示14C4与抗原结合的亲和力为2.62E-10,FACS结果证实能与U266细胞表面的gp130特异性结合,并且呈剂量依赖性,细胞增殖实验说明14C4在一定程度上可抑制IL-6诱导的U266细胞的增殖。结论:初步成功制备了抗gp130单克隆抗体,并且具备较好的生物学特性,为研究人IL-6gp130在抗感染、炎症以及肿瘤和自身免疫病学中的诊断和治疗中的意义提供了有效的工具和手段。

抗人CD130分子单克隆抗体的制备和鉴定

目的 研制抗人CD130分子的单克隆抗体。方法 以痘苗病毒为载体构建获得的可溶性CD130 (sCD130 )为免疫原 ,通过细胞融合的方法 ,得到 4株稳定分泌抗CD130单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株。结果 本组McAb对靶细胞具有识别特异性 ,可识别相对分子质量为 980 0 0的sCD130分子。

β_2糖蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)单克隆抗体(MAbs),并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的人血浆β2GPⅠ免疫BALB/c小鼠,采用PEG融合技术,间接ELISA法和有限稀释法,制备和筛选杂交瘤细胞。杂交瘤细胞继续扩大培养后注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,经硫酸铵沉淀及Protein G纯化MAbs。秋水仙素阻抑法鉴定杂交瘤细胞株染色体数目,ELISA测定滴度,Ig亚类试剂盒鉴定Ig亚类,Western blot鉴定特异性。结果:获得1株稳定分泌MAbs的杂交瘤细胞株β2,该杂交瘤细胞株的染色体数为99～108。进一步研究发现,其培养液和腹水滴度为1∶29和1∶215,其MAbs分类为IgG1/κ,Western blot显示纯化的MAbs及标准anti-β2GPⅠ与β2GPⅠ均有反应条带,具有较好的特异性。结论:成功获得并纯化β2GPⅠ单克隆抗体,为进一步研究β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ复合物在抗磷脂综合征中的作用奠定了基础。

gp130单克隆抗体B-S12的生物学特性研究

目的 研究gp130单克隆抗体B S12的生物学特性。方法 用细胞计数和3 H TdR掺入的方法观察人多发性骨髓瘤细胞株XG 1和XG 2在抗gp130的单抗B S12与它们的Fab片段和F(ab′) 2 片段作用下 ,细胞增殖和生长情况 ;此外 ,也观察gp130单抗B P8以及IL 6和IL 6R单抗B E8和B R6对B S12单抗在这 2个细胞株上作用的影响。结果 B S12可刺激XG 1和XG 2细胞增殖 ,并维持它们的长期生长 ,但B S12的这些作用有赖于它保持完整的二价结合力。B E8和B R6对B S12的作用无影响 ,B P8则可协同增强B S12的作用。结论 B S12为刺激型抗gp130的单抗 ,可起着类似于IL 6的作用。

抗HIV-1 gp41合成多肽C34单抗的制备及生物学活性

目的制备针对C34和C46单抗, 并以此为工具研究gp41表位,进一步 了解HIV-1包膜蛋白的作用机理和病毒的感染机制,为寻找新的治疗靶点提供抗体工具。 方法常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗C34与C46的单克隆抗体,并鉴定其 特异性位点，还用ELISA法、MTT法及荧光分子探针技术对单抗的生物学活性进行研究。结果获得了3株抗C34单克隆抗体、2株抗C46单抗。此5个单抗均与C34结合 , 并抑制N36肽与C34肽复合物的形成；其中效价最高的1G1对H9/HIVⅢB细胞的生长有刺 激作用 ,对H9/HIVⅢB细胞和MT-2细胞的融合无明显影响。结论得到5株 可与C34反应,并可抑制C34与N36多肽结合的单抗, 其中1G1所识别的表位可能为增强性或刺激性表位。

Gp130分子的活化在树突状细胞分化和成熟中的意义

目的 :研究激发型抗gp130分子单抗B S12对树突状细胞 (DC)分化成熟和功能的影响。方法 :人外周血单核细胞在GM CSF和IL 4作用下分化为未成熟DC后 ,加入B S12单抗 ,观察它对DC表型、摄取抗原的能力以及DC分泌IL 12、进行混合淋巴细胞反应及趋化T细胞能力的影响 ;同时比较B S12和激发型抗CD4 0单抗 5C11对DC的作用。结果 :激发型抗gp130分子单抗B S12作用于未成熟DC ,可以上调DC上CD1a和共刺激分子CD80、CD86以及成熟DC的标志CD83分子的表达 ,下调CD14的表达 ,降低DC摄取抗原的能力 ,增强DC分泌IL 12、进行混合淋巴细胞反应及趋化T细胞的能力 ,但这些作用都稍弱于 5C11对DC的作用。结论 :未成熟DC上gp130分子的直接活化可以诱导DC的分化和功能成熟。

重组人可溶性gp130的纯化及生物学活性鉴定

采用转瓶培养可溶性gp130基因转染细胞。运用免疫亲和层析法，将抗人可溶性gp130的单克隆抗体偶联于CNBr活化的Sepharose 4B。收获基因转染细胞的培养上清，经抗gp130单抗／Sepharose 4B亲和层析柱吸附，用pH2．8、0．1mol／1．甘氨酸溶液洗脱，获取可溶性gp130重组蛋白纯品。基因转染细胞培养上清中可溶性gp130的表达量为100～120μg／ml，纯化后的回收率为70％～75％，SDS-PAGE电泳后出现一条蛋白曲带。经Western blot分析，纯化的可溶性gp130能与特异性抗体结合。将可溶性gp130（终浓度为5μg／m1）与IL-6依赖性生长细胞株XG2共同培养，细胞的生长与增殖出现抑制。提示经免疫亲和层析法纯化的可溶性gp130具有良好的生物学活性。

gp130结合分子融合蛋白的表达、纯化及其mAb的制备

ｇｐ１３０结合分子（ＧＡＭ）是一种新发现的可与ｇｐ１３０胞浆内近膜区结合的蛋白质，其在ｇｐ１３０信号传导中的作用尚待深入研究。我们在原核表达ＧＡＭｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｈｉｏ）融合蛋白的基础上，制备并纯化了抗Ｔｈｉｏ的多克隆抗体，将其与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联，经亲和层析提纯该融合蛋白，以此为免疫原，通过杂交瘤技术获得了３株抗ＧＡＭｍＡｂ。其中两株为ＩｇＧ１，１株为ＩｇＧ２ａ，与Ｔｈｉｏ及空载体转染的工程菌裂解液均无交叉反应。３株ｍＡｂ腹水抗体效价为（１．２４．８）×１０－７，同变性与非变性、单体与聚合体形式的ＧＡＭＴｈｉｏ融合蛋白都能起反应，用于Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的效果满意，为ＧＡＭ的功能研究提供了重要的手段。

人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得

目的 筛选人源抗HIV 1gp12 0趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。方法 根据HIV 1gp12 0趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成 2 3肽 ,并以此为固相抗原从HIV 1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆 ,并进行鉴定及序列测定。结果 获得了 1株抗HIV 1gp12 0趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆 ,具有较高的亲和力、特异性和抑制率 ,序列测定及分析显示该抗体属IgGⅠ亚类 ,κ型 ,重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族。结论 成功地获得了人源抗HIV 1gp12 0趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。

SZ-21拮抗血管生成的初步研究

本研究的目的是从SZ 1, 2 , 2 1, 2 2 , 5 1, 6 5及 2 6 2 (GPⅡb ⅢaMcAb)中筛选出与ECV30 4 (人脐静脉内皮细胞株 )起反应的单抗 ,研究其抗血管生成的能力。用流式细胞仪筛选与ECV30 4起反应的单抗 ,用酶标法检测反应的单抗对ECV30 4、肺癌细胞株A5 4 9粘附、迁移的作用 ,采用鸡绒毛尿囊膜 (CAM)血管生成分析法观察其体外抗血管生成作用 ,以AnnexinⅤTITC盒检测单抗对A5 4 9细胞的凋亡作用。结果表明 :筛选出了与ECV30 4起反应的SZ 2 1,其对ECV30 4与基质纤连蛋白 (Fn)、胶原蛋白 (Col)Ⅳ间粘附、迁移均有抑制作用 ,鸡绒毛尿囊膜经TNF α诱导血管生成后SZ 2 1可抑制其新生。进一步研究发现SZ 2 1对肿瘤细胞A5 4 9(肺癌细胞株 )与基质Fn ,ColⅣ间粘附、迁移亦有拮抗作用 ,对A5 4 9细胞可诱导其凋亡。结论 :SZ 2 1通过对整合素 (integrin) β3的抑制和诱导凋亡的作用表现了抗血管生成的能力 ,整合素与Fn ,ColⅣ的结合部位也不限于RGD序列 。

gp130单抗协同其他造血生长因子对人脐血造血细胞体外集落形成作用

采用甲基纤维素培养体系 ,观察gp130激发型单抗联合其他造血细胞生长因子对脐血单个核细胞半固体集落形成的作用。结果表明 ,gp130激发型单抗具有显著的协同促进造血细胞体外集落形成作用 ,而且明显优于IL 6对上述因子的协同效应。因此 ,gp130激发型单抗具有潜在的体外扩增造血细胞的应用价值。

抽动秽语综合征患者血清自身抗体与可溶性白介素-6受体表达

目的探讨抽动秽语综合征（TS）患者疾病过程中免疫损伤的相关机制。方法应用抗脑抗体（ABAb）、抗核抗体（ANA）、可溶性白介素-6受体（sIL-6R）及可溶性gp130（sgp130）的ELISA方法商品试剂盒，检测患者和正常人血清中sIL-6R、sgpl30及相应抗体的含量。结果TS组血清sIL-6R、sgp130含量显著高于正常对照组（44．078±15．777）：（30．290±9．048），P〈0．01；（69．032±24．604）：（47．309±14．137），P〈0．01）；TS患儿血清ABAb、ANA检出率显著高于对照组（66．7％：3．6％，P〈0．01；53．3％：25％，P〈0．05）。且ABAb水平与sgpl30负相关（r=-0．451，P=0．046）。结论在TS患者血清中sIL-6R、sgp130水平显著增高表明依赖IL-6信号传导的生理功能上调和反馈抑制的网络机制启动；自身免疫相关的损伤机制参与了疾病发生发展的病理生理过程。

二价阳离子络合剂的抗凝剂对改良MAIPA法检测ITP血小板特异性自身抗体的影响

目的：探讨二价阳离子络合剂的抗凝剂在改良单克隆抗体俘获血小板抗原（ MAIPA）法检测免疫性血小板减少症（ITP）患者血小板特异性自身抗体的影响。方法随机选取2012年1月至2014年1月 ITP 患者159例，采用改良 MAIPA 法分别检测络合二价阳离子（EDTA-K2）及肝素钠抗凝的 ITP 患者血浆，比较两者检出率。结果 EDTA 作为抗凝剂检出阳性88例（55.35％），肝素作为抗凝剂检出104例（65.41％），两者比较差异未见统计学意义（χ2＝3.35，P ﹥0.05）；抗 GPⅡb/Ⅲa 抗体检出情况：使用 EDTA 作为抗凝剂检出阳性46例（28.93％），肝素作为抗凝剂检出91例（57.23％），两者比较差异有统计学意义（χ2＝8.99，P ﹤0.05）。结论双重抗凝剂检测可提高抗 GPⅡb/Ⅲa 抗体的检出率。