大鼠成骨细胞增殖及护骨素蛋白含量与甲状旁腺激素的调节效应

目的探讨大鼠成骨细胞增殖及护骨素蛋白含量与甲状旁腺激素的调节效应。方法选取新生清洁级健康SD大鼠作为研究对象,对其颅骨成骨细胞进行分离、培养,使用含不同浓度甲状旁腺激素的培养液进行连续培养,分别采用四甲基偶氮唑盐比色法和蛋白免疫印迹杂交法对不同时间大鼠成骨细胞增殖情况及护骨素蛋白表达情况进行测定。结果随着培养时间延长,所有组别的成骨细胞吸光度值均呈不断增加的趋势,且同一时间点的吸光度值均显著高于空白对照组,比较差异有统计学医院(P<0.05)。培养液中甲状旁腺激素的浓度为10-8mol/L条件下,各时点的吸光度最高。观察各组成骨细胞中护骨素的表达情况,可见,其与甲状旁腺激素浓度无显著相关性,但空白对照组中护骨素与actin信号比显著高于其他组别,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论甲状旁腺激素能刺激成骨细胞的增殖,并促进护骨素蛋白分泌水平下调。

α玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的探讨α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞增殖、分化的影响。方法采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为空白对照组、雌二醇阳性对照组、低浓度α-ZAL组、中浓度α-ZAL组,高浓度α-ZAL组。镜下每天观察细胞形态变化,碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞纯度,MTT实验测定细胞增殖活性绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法(ELISΑ)测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),运用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测护钙素(Osteoprotegerin,OPG)和NF-KB受体活化配体(Receptor actiator of nuclear factor-KB ligand,RANKL)的蛋白水平表达变化。结果不同浓度的α-玉米赤霉醇可显著的促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,增加细胞活性(P<0.05),明显提高小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后ALP和BMP-2的表达(P<0.05),并且显著的上调了成骨细胞内OPG/RANKL的表达率(P<0.05)。结论不同浓度的α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,并且通过上调OPG/RANKL的表达率抑制成骨细胞细胞向破骨细胞分化,有望成为临床骨折疏松症治疗的激素替代药物。

血清sRANKL/OPG比值在判断多发性骨髓瘤骨病中的意义

本研究探讨多发性骨髓瘤(MM)患者血清中可溶性核转录因子-κB受体活化因子的配体(sRANKL)和护骨蛋白(OPG)的水平与多发性骨髓瘤骨病(MBD)之间的关系。采用酶联免疫吸附法检测了42例初诊的MM病人(观察组)以及25例健康体检者(对照组)外周血清中sRANKL和OPG的水平以及破骨细胞代谢指标抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)与Ⅰ型胶原蛋白羧基末端交联肽(CTP-Ⅰ)的水平,同时根据全身X光摄片判断MM患者骨损害情况并分析sRANKL/OPG比值与TRAP-5b、CTP-Ⅰ水平和骨损害发生及其程度之间的关系。结果发现:观察组患者血清中sRANKL水平升高(中位水平9.33μg/L),OPG水平下降(中位水平4.93μg/L),sRANKL/OPG比值明显升高(比值2.65),与对照组相比各对应指标之间的差异均具有显著性(p<0.05);MM患者血清中sRANKL/OPG比值与TRAP-5b(r=0.512,p<0.05)和CTP-Ⅰ(r=0.481,p<0.05)水平之间均存在相关性。将观察组患者按有无骨损害分组发现,骨损害组(29例)和无骨损害组(13例)的sRANKL/OPG比值分别为5.13和1.12,有骨损害组的比值明显升高(p<0.05);如果按骨损害程度分组还发现,sRANKL/OPG比值与骨损害程度密切相关(r=0.445,p<0.05),但不同临床分型和不同临床分期(ISS分期)的MM患者之间,血清sRANKL/OPG比值的差异均无统计学意义(p>0.05)。结论:MM患者血清中sRANKL/OPG比值明显升高,不仅与破骨细胞代谢增强有关,还与骨损害的发生及其程度相关,所以sRANKL/OPG比值可作为判断MBD的一个参考指标。

破骨细胞活化因子与骨髓瘤骨病的关系

目的:探讨破骨细胞活化因子与骨髓瘤骨病的关系,研究其与骨损程度的关系。方法:采用实时荧光定量RT-PCR检测多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓及骨髓瘤细胞株U266中细胞核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)、护骨蛋白(OPG)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的mRNA转录情况,进而探讨其在MM骨病中的作用。结果:U266及MBD患者中,RANKL、MIP-1α及大部分NSEmRNA的转录水平显著高于对照组,且与骨损害程度基本呈正相关,MM中OPG的分泌较对照组明显减少。结论:骨髓瘤骨病是一个多因子、多系统参与的复杂的、综合作用导致的结果。

骨髓瘤的骨质破坏发生机制研究进展

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以进行性骨质破坏、多发性溶骨病变等为特征的B细胞分化终末期恶性肿瘤。其机制的关键在于破骨细胞被激活的同时成骨细胞活性受抑,最终造成骨代谢失衡。近年来,骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)分子生物学研究取得很大进展,本文对相关因子,如NFκB受体激活蛋白(RANK)、NK-κB受体激活蛋白配体(RANKL)、护骨蛋白(OPG)、巨噬细胞炎性蛋白-α(MIP-1α)、基质衍生基子1(SDF1)及Wnt通路等研究进展进行综述。

重度烧伤患者早期血清护骨因子/核因子κB受体激活蛋白配体和钙磷相关指标的变化

目的了解重度烧伤患者早期血清护骨因子/核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)和钙磷相关指标的变化。方法将2017年6月-2018年12月武汉大学同仁医院暨武汉市第三医院收治的符合入选标准的30例伤后8 h内入院的重度烧伤患者纳入重度烧伤组[男24例、女6例,年龄(38±13)岁],同期招募该单位体检中心体检结果正常的10名健康志愿者纳入健康对照组[男7名、女3名,年龄(37±8)岁],进行前瞻性对照研究。重度烧伤组患者于伤后1、7、14、21、28 d各抽取5 mL空腹静脉血,健康对照组志愿者取5 mL空腹静脉血,采用酶联免疫吸附测定法检测血清中护骨因子、RANKL、25羟维生素D及甲状旁腺激素(PTH)水平并计算RANKL/护骨因子比值,分别采用溴甲酚绿法、甲基百里酚蓝比色法和磷钼酸法测定血清白蛋白、血钙和血磷水平。对数据行Fisher确切概率法检验、重复测量方差分析、独立样本t检验、Mann-Whitney U检验以及Bonferroni校正。结果(1)重度烧伤组患者伤后1、7、14、21、28 d血清护骨因子水平分别为155.11(102.91,187.02)、170.07(84.60,196.86)、174.95(59.09,208.35)、190.01(47.08,214.52)、188.85(58.73,223.13)pg/mL,均明显高于健康对照组志愿者的33.34(28.59,45.68)pg/mL,Z=-3.436、-4.311、-3.248、-2.811、-4.217,P<0.01;血清RANKL水平分别为(1869±791)、(1746±857)、(1781±713)、(2015±825)、(2272±583)pg/mL,均明显高于健康对照组志愿者的(49±16)pg/mL,t=12.600、10.844、13.294、13.041、20.880,P<0.01;RANKL/护骨因子比值分别为12.23(8.10,24.73)、11.40(8.25,16.96)、11.15(6.91,38.32)、12.98(9.22,49.68)、13.91(10.29,40.68),均明显高于健康对照组志愿者的1.17(0.91,1.74),Z=-4.560、-4.529、-4.529、-4.560、-4.623,P<0.01。(2)重度烧伤组患者伤后1 d血清25羟维生素D水平明显低于健康对照组志愿者(Z=-2.749,P<0.01)。与健康对照组志愿者比较,重度烧伤组患者伤后1、7、14、21、28 d血清白蛋白水平明显降低(t=-4.374、-7.689、-8.257、-7.651、-6.259,P<0.01),血清PTH水平明显升高(Z=-4.685、-4.685、-4.685、-4.654,-4.685,P<0.01),血磷水平无明显变化。重度烧伤组患者伤后1、7、14、21 d血钙水平明显低于健康对照组志愿者(Z=-2.375、-3.455、-2.442、-2.016,P<0.05或P<0.01)。结论重度烧伤患者早期血清护骨因子、RANKL、RANKL/护骨因子比值、PTH升高,25羟维生素D、白蛋白及血钙下降,这可能是导致患者骨质流失的机制。

基于OPG/RANKL/RANK信号通路探讨桂枝芍药知母汤对胶原诱导性关节炎大鼠的影响

目的基于护骨因子(OPG)/NF-κB受体激活蛋白配体(RANKL)/NF-κB受体激活蛋白(RANK)信号通路探究桂枝芍药知母汤对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠骨破坏与骨保护相关因子的影响。方法60只雌性Wistar大鼠按照体质量随机分为6组,正常组、模型组、雷公藤多苷组(0.01 g/kg)、桂枝芍药知母汤低剂量组(8.6 g/kg)、桂枝芍药知母汤中剂量组(17.2 g/kg)、桂枝芍药知母汤高剂量组(34.4 g/kg),每组10只。除正常组外,其他大鼠第1、8天使用牛Ⅱ型胶原蛋白(100μg)复制CIA模型,在大鼠左足足底和尾根部位注射。造模成功后灌胃给药4周。监测大鼠一般状态、体质量及关节炎指数(AI)评分,酶联免疫吸附测定法检测大鼠血清中RANKL、OPG的含量,实时荧光PCR法与蛋白质印迹法分别测定踝关节中RANKL、RANK、OPG mRNA与蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组一般状态欠佳,足趾肿胀明显,AI评分升高,血清RANKL含量升高、OPG含量降低,踝关节RANKL、RANK mRNA与蛋白表达均升高(均P<0.05)。与模型组比较,桂枝芍药知母汤各剂量组大鼠足趾肿胀程度与AI评分下降,血清RANKL含量降低、OPG含量升高,踝关节中RANKL、RANK mRNA与蛋白表达均降低,OPG mRNA与蛋白表达均升高,踝关节RANKL/OPG值降低(均P<0.05)。结论桂枝芍药知母汤能够改善CIA模型大鼠关节的骨破坏情况,其作用机制可能与降低RANKL水平、降低RANKL/OPG值、调控骨平衡有关。

严重烧伤大鼠骨形成与骨吸收相关指标的变化

目的研究严重烧伤大鼠骨形成及骨吸收相关指标的变化。方法采用实验研究方法。将30只6~8周龄SD雌性大鼠按随机数字表法分为假伤组、12%体表总面积(TBSA)Ⅲ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组,每组10只。于各组大鼠背部进行相应处理,之后仅烧伤大鼠按Parkland公式经腹腔注射补液,创面外涂20 g/L碘伏,直至创面愈合。伤后28 d,取各组大鼠胫骨组织,分别行Masson、抗酒石酸酸性磷酸酶染色,观察新生骨组织、破骨细胞数量;取各组大鼠腹主动脉血制备血清,分别采用甲基百里酚蓝比色法、磷钼酸法测定骨代谢指标血清钙离子、磷离子浓度,采用酶联免疫吸附测定法检测血清中骨形成标志物Ⅰ型前胶原氨基端前肽(P1NP)和骨吸收标志物β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTX)水平;取各组大鼠第1腰椎组织,采用实时荧光定量反转录PCR法检测护骨因子、核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF-6)、活化T细胞核因子1(NFATC1)、c-Fos、c-Src的mRNA表达水平。数据处理采用单因素方差分析、Bonferroni法、Welch检验、Games-Howell检验、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验及Bonferroni校正。结果伤后28 d,与假伤组比较,2个烧伤组大鼠胫骨组织中新生骨组织生成均减少,烧伤面积越大减少越明显;2个烧伤组大鼠胫骨组织中破骨细胞数量相近,均较假伤组明显增多。伤后28 d,3组大鼠血清钙离子浓度、血清中β-CTX水平相近(P>0.05);24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清磷离子浓度明显高于12%TBSAⅢ度烧伤组(P<0.05),且2个烧伤组大鼠血清磷离子浓度均显著高于假伤组(P<0.01);24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中P1NP水平明显低于假伤组(P<0.01)。伤后28 d,假伤组、12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中护骨因子mRNA表达水平分别为1.01±0.20、1.71±0.83、2.24±0.51,其中24%TBSAⅢ度烧伤组明显高于假伤组(P<0.01);24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中RANKL mRNA表达水平为1.31±0.17,明显高于假伤组的1.00±0.14与12%TBSAⅢ度烧伤组的0.97±0.10(P<0.01);12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中TRAF-6、NFATC1(Z=3.141、3.782)、c-Src mRNA表达水平及12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中c-Fos mRNA表达水平均明显高于假伤组(P<0.05或P<0.01);12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中c-Fos、c-Src mRNA表达水平均明显高于24%TBSAⅢ度烧伤组(P<0.01)。结论严重烧伤可引起大鼠新生骨组织生成减少及破骨细胞数量增多,血清磷离子浓度升高与血清中P1NP水平下降,骨组织中护骨因子、RANKL、TRAF-6、NFATC1、c-Fos、c-Src呈升高趋势,且NFATC1、c-Fos、c-Src随烧伤总面积增加呈下降趋势。