报告基因技术及其在土壤质量监测中的应用

报告基因包括lux、gfp、lacZ、inaZ、luc、cat、xylE及uidA等,其中土壤质量监测中最常用的报告基因有lux、gfp、lacZ和inaZ4种。从不同角度比较了土壤质量监测中最常用的上述4种报告基因,简要阐述了应用于土壤质量监测中的微生物监测报告基因的定义、类别、性质及特点,展示了报告基因表达系统的构建方式与检测方法,总结了报告基因技术在监测土壤重金属、污染物质、营养物质等化学物质以及在土壤微生物及其活动、土壤根际微生物与土壤中原生动物、植物间的相互作用等方面的应用。讨论了目前报告基因技术应用的局限性及未来研究方向和重点。

报告基因技术的理论基础及其应用

报告基因技术广泛地应用于监测细胞的信号转导和基因表达,通过把转录控制元件剪接到报告基因,可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。这种检测具有敏感性高、方便、可靠而且适用于大规模检测等优点。随着报告基因技术及其检测方法的不断改进,荧光素酶、绿色荧光蛋白以及新近克隆出的红色荧光蛋白作为无害性的检测工具,将在检测活体组织和细胞基因表达方面得到越来越广泛的应用。此外,在研究疾病发生的分子机制,基因治疗和药物开发方面,报告基因技术也将发挥出重要作用。本文对报告基因技术的基础理论、常用报告基因的种类和特点,以及其目前的主要应用作了概括性介绍。

利用ChIP-seq/双荧光素酶报告基因技术验证PPARγ2的靶向基因MYH7

为验证2型过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ_(2),PPARγ_(2))对编码β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)基因MYH7的靶向调控机制及其结合位点,本研究将pTT5空载体和pTT5-3flag-PPARγ_(2)质粒分别转染小鼠心肌细胞(mouse cardiac myocytes,MCM),RT-qPCR和Western blot检测MYH7和PPARγ_(2)的表达情况;利用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipita-tion,ChIP)特异性富集并纯化MCM中可与PPARγ_(2)结合的DNA片段,通过高通量测序技术(high-throughput sequencing,HiSeq)检测和分析可直接与PPARγ_(2)结合的基因。采用生物信息学软件预测PPARγ_(2)结合于靶标基因MYH7的启动子区,并将预测到的转录因子结合位点和相应的突变位点分别插入pgl3-basic载体的萤火虫荧光素酶基因上游,构建野生型和突变型荧光素酶报告质粒,再分别与pcDNA3.1载体、pcDNA3.1-PPARγ_(2)质粒和海肾荧光素酶基因载体pRL-TK共转染293T细胞,检测荧光素酶相对活性。实验结果表明:ChIP-seq初步验证了MYH7是PPARγ_(2)直接调控的可能靶向基因;经基因测序验证MYH7野生型和突变型荧光素酶质粒(pgl3-basic-MYH7-WT、pgl3-basic-MYH7-mut)构建成功;双荧光素酶报告基因检测显示,与MYH7-WT+pcDNA3.1组的相对荧光素酶活(0.366±0.021)相比,MYH7-WT+pcDNA3.1-PPARγ_(2)组的相对荧光素酶活性(2.477±0.212)增强,差异具有统计学意义(P<0.001);与MYH7-WT+pcDNA3.1-PPARγ_(2)的相对荧光素酶活(2.477±0.212)相比,MYH7-mut+pcDNA3.1-PPARγ_(2)组的相对荧光素酶活性(2.677±0.201)无明显变化(P>0.05)。本研究通过ChIP-seq/双荧光素酶报告基因技术初步验证PPARγ_(2)能够直接结合MYH7的启动子区域并靶向正调控MYH7基因的表达。

药物高通量筛选分析技术

高通量筛选分析技术在药物研究中已有大量应用 ,除化合物的药理活性 ,还涉及药代动力学性质、不良反应等的检测分析。本文分类列述了一些近年在药物研究中应用的高通量筛选分析方法 ,对大多数方法的原理进行了简述。认为自动化技术、“同质”技术和报告基因技术等对实现高通量筛选分析具有重要意义。另外 ,对高通量筛选算法研究也进行了介绍。

微小RNA-145-5p调控视网膜β-catenin对小鼠眼轴的影响

目的:探讨mi R-145-5p调控视网膜β-catenin表达对小鼠眼轴的影响。方法:取18只雄性3周龄C57BL/6小鼠按照随机数字表法随机分成对照组,miR-145-5pmimics组和miR-145-5p对照组。分组第2,5,8天双眼玻璃体腔注射1次药物,共注射3次:对照组小鼠玻璃体腔内注射3μL枸橼酸盐缓冲液,miR-145-5p mimics组小鼠玻璃体腔内注射3μL含有3μg miR-145-5p mimics的枸橼酸盐缓冲液,miR-145-5p对照组采取同样方法注射3μg miR-145-5p对照载体。最后一次注射完成3 d后A超测量小鼠眼轴长度,之后取小鼠视网膜组织,采用RT-PCR技术检测视网膜中miR-145-5p和β-catenin的表达,采用Western印迹法检测视网膜组织中β-catenin的含量。取6只成年雄性C57BL/6小鼠,构建β-catenin mRNA 3'UTR荧光素酶过表达载体,将β-catenin mRNA 3'UTR荧光素酶过表达载体与miR-145-5p mimics共同转染小鼠视网膜组织,3 d后取视网膜组织,应用荧光素酶报告基因技术检测和验证miR-145-5p与β-catenin的相关性。结果:视网膜转染miR-145-5p mimics后,小鼠眼轴长度降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.05),视网膜组织中miR-145-5p表达上升,β-catenin在mRNA和蛋白水平表达均下降(P<0.05)。视网膜转染miR-145-5p对照后,视网膜组织中miR-145-5p表达以及β-catenin的蛋白含量未见明显变化(P>0.05);荧光素酶报告基因结果显示转染miR-145-5p和β-catenin mRNA 3'UTR荧光素酶过表达载体后,视网膜组织中荧光活性显著降低(P<0.001)。结论:miR-145-5p能够下调视网膜β-catenin的表达,进而控制眼轴增长。

褐牙鲆中miRNAs与甲状腺激素受体TRβ的相互作用研究

甲状腺激素通过与其受体结合对褐牙鲆变态起重要的调控作用,而miRNAs通过结合靶基因3′-UTR在转录后水平调节靶基因的表达。为探讨miRNAs在褐牙鲆变态中的作用,通过生物信息学方法预测褐牙鲆TRβ基因3′-UTR存在的miRNAs结合位点,并利用3′-RACE方法克隆TRβ基因的3′-UTR序列,通过体外DNA重组技术构建应用于miRNAs靶向基因检测的双荧光素酶重组报告载体,利用细胞转染和双荧光素酶报告技术分析多个miRNAs与TRβ基因的作用关系。研究结果显示,克隆得到了一段长为437 bp的褐牙鲆TRβ基因的3′-UTR序列,发现3′-UTR序列上存在pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p、pol-miR-138和pol-miR-125a*的结合位点,成功构建了双荧光素酶重组报告载体,命名为pmirGLO-TRβ-3′-UTR。双荧光素酶报告分析结果表明,pol-miR-125a、pol-miR-214、pol-miR-460-5p和pol-miR-138均为作用于褐牙鲆TRβ的靶向miRNAs,而pol-miR-125a*对TRβ基因无直接的调节作用。研究结果将为后续深入研究miRNAs与TRβ在褐牙鲆变态发育中的功能及其作用机制提供基础。

绵羊Musclin基因5’调控区元件的预测和分析

Musclin是由Nishizawa等(2004)采用信号序列捕获(signal sequence trap,SST)技术在小鼠首次发现的一种肌源性细胞因子,与肌肉的营养代谢有关。为了研究Musclin基因在骨骼肌的转录调控机制,我们克隆了绵羊Musclin基因的部分5’调控区序列,分析了不同物种之间的同源性。

选择合适的萤光素酶照亮您的路程

现有的多和萤光素酶检捌方法和多种萤光素酶基因使得您能根据实验目的选择最好的组合。我们在这里讨论一些Promega公司提供的萤光报告基因技术的特点，并叙述如何利用这些技术来满足您的需要。