基于颗粒酶B启动子的磁共振报告基因成像监测CAR-T细胞激活状态

目的利用颗粒酶B(granzyme B,GB)启动子控制铁蛋白(ferritin heavy chain,FTH1)报告基因表达,探讨通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)监测嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T细胞)激活状态的可行性。方法通过Ficoll密度梯度离心法以及流式分选得到细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)。将GB启动子和FTH1基因连接,连同二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside 2,GD2)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)以慢病毒为载体转入CTLs,构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1细胞,以GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T和T细胞为对照。CytoTox96@非放射性细胞毒性检测各组细胞与人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)共培养后的杀伤效果,ELISA检测共孵育因子以及GB分泌量,Western blot、普鲁士蓝染色、细胞MRI检测共培养后FTH1基因的表达。结果成功获得CTLs并构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1、GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T细胞,3组细胞对肿瘤细胞杀伤效果、共孵育因子以及GB分泌量均显著高于T细胞组,GB表达水平在与SK-N-SH细胞共培养后1 d最高,3 d和7 d依次降低。GD2-CAR-T/pGB-FTH1组FTH1相对表达量以及铁含量变化趋势与GB表达一致,MRI信号呈逐渐升高趋势。GD2-CAR-T/pCMV-FTH1组FTH1相对表达量、铁含量及MRI信号在各时间点均无显著差异。GD2-CAR-T和T细胞组无明显FTH1表达及聚铁效应。结论基于GB启动子的MRI报告基因成像可实时反映CAR-T细胞的GB表达水平和肿瘤杀伤作用,为CAR-T治疗提供了一种监测细胞激活状态的可视化手段。

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

基于Wnt/β-catenin信号通路的DKK-1抗体药物生物活性报告基因法开发与评估

生物活性检测对于确保治疗性抗体的安全性和有效性至关重要,需要准确反映药物的作用机制(MOA)。作为一类新兴靶点药物,DKK-1抗体在骨质疏松和肿瘤治疗领域展现出巨大潜力。然而,当前针对DKK-1抗体的生物活性评价主要基于碱性磷酸酶活性测定,该方法存在操作复杂、耗时长及结果变异性大等问题,在一定程度上限制了此类抗体的研发及质控。为了建立一种DKK-1抗体高性能生物活性检测方法,本研究引入了报告基因法(RGA),通过将TCF/LEF反应元件控制的稳定表达荧光素酶的报告基因质粒转染HEK 293细胞,成功建立了一种基于DKK-1抗体MOA的Wnt/β-catenin信号通路的报告基因检测方法。该方法经过优化及模拟实验评估,显示出在实际应用中的潜力和可靠性。该新方法的建立预计将进一步促进DKK-1抗体类药物的筛选评估及其在后续开发过程中的质量控制。

大规模平行报告基因测定:一种分析基因表达调控的新技术

大规模平行报告基因测定(massively parallel reporter assay,MPRA)是一种可以同时研究基因组数千个调控元件活性的高通量分析方法。该方法在传统的荧光素酶报告基因载体上引入一段具有唯一标识的条形码,通过二代测序技术对转染前的DNA条形码和转染后的mRNA条形码进行测序,用mRNA和DNA条形码读数的比值来分析顺式调控元件的活性。自MPRA提出以来,已被广泛应用于基因组顺式调控元件和功能性变异的鉴定、转录后调控对表型的影响等方面的研究。本文对MPRA的发展历程、基本原理、实验流程、统计分析方法以及在顺式调控元件和转录后调控方面的应用进行了综述,并对其发展前景进行了展望,以期为相关领域研究人员了解与应用MPRA提供有益参考。

磁共振报告基因成像原理及应用进展

近年来,随着磁共振分子成像方法的发展及新序列的不断开发,磁共振分子成像在疾病早期诊断、细胞示踪及基因分析等领域应用越来越广泛。磁共振报告基因成像作为磁共振分子成像的重要分支,也备受关注。而磁共振报告基因种类繁多,因其成像原理不同导致其应用领域各不相同,熟知磁共振成像报告基因的成像原理及其优缺点是合理应用它的前提。本文将从成像原理、研究前沿及未来发展方向等方面对磁共振报告基因进行综述,期望以此提高磁共振分子成像效能及安全性,推动磁共振分子成像技术发展。

一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用

为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。

孕烷X受体双荧光素酶报告基因方法建立及有机磷酸酯阻燃剂的受体激活效应研究

孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是一种调控生物体异源性/内源性物质代谢的核受体。环境污染物可介由PXR改变人体代谢稳态进而增加多种代谢性疾病风险,但目前尚缺乏一种灵敏、稳定的检测化学品PXR结合活性的体外实验方法。本研究基于重组基因技术构建了带有海肾荧光素酶基因的pBIND-hPXR表达质粒,将其与插入上游激活序列的荧光素酶报告基因质粒GAL4-UAS-Luc共转染至HEK 293T细胞,最终成功建立了一种可筛查化学品人孕烷X受体激动/拮抗作用的双荧光素酶报告基因检测方法,该方法具有灵敏度高、适用范围广和重复性好的特点。进一步检测了9种典型有机磷酸酯(organophosphate esters,OPEs)阻燃剂的hPXR激活效应,结果表明芳基类OPEs的激活活性强于氯代和烷基类OPEs,其中磷酸三甲苯酯(TCP)的20%最大效应浓度(基于阳性对照)及最大激活效应值和已知的hPXR强激动剂利福平相当。此外,首次发现2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)在略高于人体血液最高检出浓度(80 nmol·L^(-1))的染毒组(316.2 nmol·L^(-1))即表现出显著的hPXR激活效应。本方法有助于研究化学品对PXR受体信号通路的扰动作用,并为OPEs类化学品的健康风险评估提供科学依据。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

基于Golden Gate高效构建psiCHECK双荧光素酶报告基因的方法及应用

目的 基于Golden Gate技术构建psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,并探讨其能否用于RNA干扰(RNA interference, RNAi)药物筛选。方法 通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CcdB致死基因、氯霉素基因与Golden Gate组装所需的BsmBI酶切位点,将其克隆至psiCHECK-2载体,构建出重组载体psiCHECK-CcdB。利用2种大肠杆菌DB3.1与DH5α对该载体的致死效率进行检测,选用1 387 bp大小的外源片段克隆至psiCHECK-CcdB载体,检测其连接效率,并验证重组载体能否发挥双荧光素酶报告系统功能,监测目的基因的表达变化。结果 菌落PCR以及测序鉴定psiCHECK-CcdB重组质粒构建成功,该质粒可有效致死无法耐受CcdB毒素的大肠杆菌DH5α菌株,在DB3.1菌株中正常生长。采用Golden Gate的方法可将外源片段简单快速克隆至psiCHECKCcdB载体中,连接效率显著提高且低背景克隆。通过测定双荧光素酶表达强度,证实了小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向性结合目的基因可显著下调荧光素酶的表达,成功发挥双荧光素酶报告基因功能。结论 本研究成功构建了psiCHECK-CcdB重组双荧光素酶报告载体,应用Golden Gate组装技术,简化了实验操作流程,降低了实验成本,具备较高的阳性克隆率与多片段一次性组装的潜力,在RNAi药物筛选领域应用前景广阔。

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。

基于报告基因和PPARγ信号通路的药物筛选模型的建立

目的 建立基于报告基因和PPARγ(peroxisomeprolif erator activatedreceptorγ)信号通路的药物筛选模型,用此模型筛选具有胰岛素增敏活性的小分子化合物。方法 五种细胞分别进行瞬时转染,将含有目的片段PPRE(peroxisomeproliferatorresponseelement)和报告基因荧光素酶(Luc)的质粒及表达PPARγ的质粒共转染到细胞中,通过测定荧光素酶活力来考察马来酸罗格列酮对PPARγ信号通路的影响,选取诱导表达倍数最高的细胞株建立模型。用其他类型核受体激动剂对此模型进行特异性考察。结果 293T细胞中,荧光素酶的表达受马来酸罗格列酮的诱导倍数最高,可达4 9倍,并呈现一定的剂量依赖关系,Z′因子为0 .72。而其他各类核受体激动剂的诱导表达率均在1倍左右。马来酸罗格列酮在转染剂量范围内无促进细胞增殖的作用。结论 马来酸罗格列酮对共转染报告基因质粒和表达PPARγ质粒的293T细胞Luc的表达具有较强的诱导作用,此模型具有较好的特异性和稳定性,适用于建立筛选PPARγ激动剂的高通量筛选模型。

外源报告基因EGFP在盐藻中实现瞬时表达

探索杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的转基因方法和筛选方法 .利用烟草花叶病毒启动子 (CaMV35S)、衣藻叶绿体atpA启动子与来源于水母的加强型绿色荧光蛋白报告基因 (EGFP)构建表达载体pART7GFP和pUCGFP ,转化盐藻 .EGFP在CaMV 35S启动下表达出绿色荧光蛋白 ,在荧光显微镜下看到发绿色荧光的转基因盐藻 .根据荧光数目进行统计 ,转化效率高于 5 % .衣藻来源的启动子atpA在盐藻中未能启动EGFP的表达 .用直径 1μm的金粉颗粒和 0 6 μm的金粉进行基因枪法转化 ,1μm的金粉颗粒成功将外源基因导入盐藻 ,用 0 6 μm的金粉配合多种技术参数也没有将外源基因导入盐藻 .EGFP可以用作盐藻遗传转化的报告基因使单细胞真核生物盐藻可以利用流式细胞术 (FACS)等技术进行筛选 ,从而避开平板筛选转基因盐藻的限制 。

报告基因的选择及其研究趋向

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。由于具有灵敏度高、检测方便等特点,报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用。近年来,随着荧光分析方法和技术的进步,荧光素酶和绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀,本文以这两个报告基因为重点,综述了报告基因的特点、应用、近年来的进展以及未来发展方向。

基于报告基因的雌激素受体β亚型激动剂细胞筛选模型的建立

目的建立基于报告基因和雌激素受体β(estrogen receptorβ,ERβ)亚型信号通路的药物筛选模型,以期发现ERβ亚型激动剂。方法构建带有雌激素应答序列(estrogen responsive elem ent,ERE)靶序列和报告基因的诱导性表达载体pTAL-ERE-SEAP,并将其转入人胚肾(HEK293)细胞中,筛选报告基因分泌型碱性磷酸酶(secretedalkaline phosphatase,SEAP)表达受雌二醇(17β-estrad iol,E2)诱导的阳性克隆。选取相关核受体配体进行模型的特异性考察,同时考察模型的稳定性及时效量效关系,以及免疫细胞化学染色鉴定转染后ERβ的表达情况。利用此模型对本实验室样品库中的2 622个化合物进行筛选。结果转染pTAL-ERE-SEAP的HEK293细胞中,SEAP报告基因的表达受E2的诱导并呈剂量与时间依赖关系,E2对阳性克隆细胞无增殖作用,本模型的Z′因子值为0.7,免疫细胞化学染色结果表明,转染后ERβ表达、地塞米松以及其他配体的诱导表达率低。结论利用此模型通过测定SEAP报告基因的诱导表达水平可筛选ERβ亚型激动剂。

报告基因技术及其在土壤质量监测中的应用

报告基因包括lux、gfp、lacZ、inaZ、luc、cat、xylE及uidA等,其中土壤质量监测中最常用的报告基因有lux、gfp、lacZ和inaZ4种。从不同角度比较了土壤质量监测中最常用的上述4种报告基因,简要阐述了应用于土壤质量监测中的微生物监测报告基因的定义、类别、性质及特点,展示了报告基因表达系统的构建方式与检测方法,总结了报告基因技术在监测土壤重金属、污染物质、营养物质等化学物质以及在土壤微生物及其活动、土壤根际微生物与土壤中原生动物、植物间的相互作用等方面的应用。讨论了目前报告基因技术应用的局限性及未来研究方向和重点。

报告基因及其应用研究进展

报告基因是现代分子生物学研究领域中用于分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具,在解析基因时空表达调控的内在规律中发挥着重要作用,它具有便捷、可靠、灵敏度高和适用于大规模检测等优点.对目前已发展的多种报告基因(氯霉素转乙酰酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶以及荧光蛋白等)在动物、植物、微生物以及医学等领域的应用情况进行综述,为该技术的进一步拓展应用提供新线索和新思路.

四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达

以红色荧光蛋白基因(RFP)为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyxmori细胞(Bm-e-HNU5),观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子(A4)、α微管蛋白基因启动子(α-tub)、蚕丝心蛋白重链基因启动子(Fib)和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子(IE)4种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达情况。构建的重组表达质粒pDsRed-α-tub、pDsRed-A4、pDsRed-IE和pDsRed-Fib经双酶切和PCR鉴定正确无误。转染和转录实验结果表明,除了pDsRed-A4外,其他3种重组质粒在Bm-e-HNU5细胞中都得到高转染率,α-tub、IE和Fib可依次增强RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达活性。

荧光素酶报告基因法测定废气中二噁英类物质

研究二噁英类生物检测法的主要目的是简化二噁英类分析流程,并找出快速检测的结果与HRGC-HRMS(高分辨气相色谱-高分辨质谱)结果之间的换算系数,从而可以利用快速检测的结果和换算系数来推算HRGC-HRMS的结果.介绍了CALUX(荧光素酶报告基因法)分析废气中二噁英类物质的原理,并采用该方法分析了我国27个废气样品,以期找出其测定结果与HRGC-HRMS结果之间的换算系数.结果表明,这2种测试方法数据相关性显著,R2为0.994 8,数据间的换算系数为0.379.试验表明,CALUX法具有很好的推广性,如果再适当增加废气样品的数量,对换算系数进行适当的优化,则所得换算系数可推广.

TNF-α3′-UTR双荧光素酶报告基因系统的构建及丹参酮类药物筛选

目的构建并鉴定p GL3-TNF-α3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,以此基于调控TNF-α转录后水平对丹参酮类成分进行筛选。方法反转录人脐静脉内皮细胞HUVEC的mRNA成c DNA,以之为模板,PCR扩增含TNF-α3'-UTR的DNA片段全长,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p GL3-control上,构建出p GL3-TNF-α3'UTR全长的荧光素酶报告基因载体并进行鉴定。将所构建的p GL3-TNF-α3'UTR与p SVRenilla质粒组成双荧光素酶报告系统共转染至单核巨噬细胞RAW264.7,经脂多糖诱导后利用该双荧光素酶报告基因表达系统判定丹参酮类成分对TNF-α转录后调控是否有影响。结果成功构建p GL3-TNF-α3'UTR荧光素酶报告基因,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致。脂多糖(LPS)可以明显诱导转入p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光强度。丹参酮类成分中隐丹参酮可以明显降低LPS诱导的p GL3-TNF-α3'UTR载体细胞的荧光素酶活性。结论成功构建含TNF-α3'UTR区的双荧光素酶报告基因表达系统,并以此从丹参酮类化合物中筛选出隐丹参酮,可以对TNF-α的转录后水平进行抑制调控。

绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究(英文)

本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) .