利用人胚胎干细胞来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系追踪成年造血过程

Runt相关转录因子1c(Runt-related transcription factor 1c,Runx1c)与成年造血以及造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的产生密切相关,为了动态追踪人早期造血发育过程中Runx1c的表达,利用双切质粒载体联合瞬时转入B细胞淋巴瘤-特大(B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL)基因的CRISPR-Cas9技术高效地构建了人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系,并经PCR、Sanger测序验证构建成功。随后,利用免疫荧光技术、实时荧光定量PCR技术、流式细胞术、畸胎瘤实验和数字化核型分析技术进行验证,发现该报告细胞系仍具有hESC样的多能性且未发生染色体异常和变异。此外,通过hESC体外单层诱导造血分化方法,利用流式细胞术追踪人早期造血发育过程中Runx1c的表达,结果表明利用该报告细胞系可以动态追踪人早期造血发育中Runx1c的表达。研究结果为阐明成年造血过程提供了新思路,并为体外产生功能性血细胞提供了可能。

应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系筛选抗病毒药物的研究

目的应用构建的水痘．带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MVgG建立一种筛选抗VZV药物的新方法。方法将VZV疫苗株（vOka）的无细胞病毒液（CFV）直接感染MV9G细胞2h后移除（CFV直接感染法），或将感染vOka株的Mewo细胞（含带细胞病毒，CAV）与MV9G细胞共培养48h（CAV共培养法），以激发MV9G细胞表达报告基因萤火虫荧光素酶。在培养基中加入肝素、磷酸甘露糖（M-6-P）、阿昔洛韦（ACV）、白藜芦醇、roscovitine等抗病毒药物，通过比较加药前后MV9G细胞荧光素酶活性变化来分析药物对VzV的作用。结果抗病毒药物各浓度组不同程度地抑制CFV直接感染和／或CAV共培养激发的MV9G细胞荧光素酶活性，荧光素酶活性的降低与平行对照组中病毒蚀斑数的降低一致。抗病毒药物中肝素、M-6-P和roscovitine2．5μmol／L组抑制CFV激发荧光素酶的作用强于抑制CAV激发荧光素酶的作用，而ACV和白藜芦醇抑制CAV激发荧光素酶的作用强于抑制CFV激发荧光素酶的作用。ACV抗药株Kanno和rOkaYSR的CAV与MVgG细胞共培养均激发其强表达荧光素酶，但ACV抑制抗药株激发荧光素酶50％时浓度（IC50）显著高于抑制敏感株pOka和CaGu的IC50。结论CFV直接感染法和CAV共培养法分别有助于筛选针对VZV感染早期和后期的药物，利用MV9G细胞建立的报告细胞法可为抗VzV药物筛选和作用机制研究提供一种简便、快速、敏感和高通量的新方法。

利用CRISPR/Cas9技术对VSX 2绿色荧光报告基因人诱导多能干细胞系的构建

目的构建表达视觉系统同源框2(VSX 2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。方法根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理,设计VSX 2的小向导RNA(sgRNA),构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒;2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系,采用嘌呤霉素筛选获得单克隆,扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型;采用核型分析法分析报告细胞系核型;采用STR法排除细胞交叉污染;采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达;通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力;应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官,并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。结果电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有VSX 2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明,BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性,包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明,由BC1-VSX 2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性;eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。结论成功构建1株表达VSX 2-eGFP报告基因的hiPSCs,该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化,为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

水痘-带状疱疹病毒报告细胞系的构建及特性分析

目的利用水痘-带状疱疹病毒（VZV）ORF9启动子的最短有效序列ORF9G和ORF61启动子的最短有效序列ORF61F构建VZV报告细胞系并分析其特性。方法分别将ORF9G和ORF61F自身首尾连接得到串联启动子TgG和T61F，再分别将TgG和T61F克隆到报告子质粒pGL3-basic中构建串联启动子-报告子重组质粒pGL-TgG和pGL-T61F，质粒中报告基因萤火虫荧光素酶的表达由上游串联启动子控制；将pGL-TgG、pGL-T61F分别同G418抗性质粒pCMV-script恒定转染到人黑色素瘤细胞系MeWo后培养至G418抗性细胞克隆生长；收集G418抗性细胞克隆，测定其感染VZV后萤火虫荧光素酶的表达强度，筛选信噪比高的细胞克隆作为VZV报告细胞系，并分析其灵敏度、特异性等主要特性。结果串联启动子TgG和T61F分别较其单拷贝启动子9G和61F活性增加1倍；分别利用pGL-TgG和pGL—T61F成功构建了VZV报告细胞MV9G和MV61F；两个报告细胞在感染最低50PFU VZV 24h时即能检测到萤火虫荧光素酶的强表达，表达强度与感染病毒量呈线性正相关，但感染人巨细胞病毒（HCMV）、人类疱疹病毒6（HHV-6）和HHV-7时无表达；MV9G的灵敏度较MV61F略高。结论MV9G和MV61F均可作为敏感、特异的VZV报告细胞系供进一步研究用。

双重数字PCR法评价Luc2P系列报告基因细胞系的稳定性

目的 建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法 提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性。结果 未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10%,Luc和RPP30的线性拟合R~2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50%~100%之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致。该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致。结论 建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价。