哺乳动物基因组靶向修饰阳性细胞富集的报告载体系统研究进展

基因组靶向修饰技术对基因功能研究、基因治疗以及转基因育种研究都具有重要的意义和价值。近年来发展起来的人工核酸酶如ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等的应用大大提高了基因组靶向修饰的效率。但是由于核酸酶表达载体转染效率、核酸酶表达效率及活性以及基因组被打靶后的修复效率等因素在一定程度上制约着基因组靶向修饰阳性细胞的获得。因此富集和筛选基因组靶向修饰阳性细胞是一个亟待解决的问题。报告载体系统可以间接地反映核酸酶的工作效率并有效富集核酸酶修饰的阳性细胞,进而提高基因组靶向修饰阳性细胞的富集和筛选效率。本文主要针对由非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)和单链退火(Single-strand annealing,SSA)两种修复机制分别介导的报告载体系统的原理和应用进行了详细的介绍,以期为以后的相关研究提供借鉴和参考。

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用

报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用m RFP-e GFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

靶向敲除猪ApoE基因的CRISPR/Cas9系统构建及基因组检测

通过敲除猪的ApoE基因,为后期构建ApoE缺陷型动物模型奠定基础。利用CRISPR/Cas9系统和实验室前期构建的报告载体,分别构建了靶向猪ApoE基因的两个CRISPR/Cas9表达载体和相应的报告载体。通过CRISPR/Cas9表达载体和RG(Red-GFP)报告载体转染HEK 293T细胞荧光观察结果显示,构建的CRISPR/Cas9表达载体均有较高的活性,进一步在流式细胞仪上检测其活性分别为6.50%和6.83%。将CRISPR/Cas9表达载体和RPG(Red-PuroR-GFP)报告载体转染PK15细胞系,经过嘌呤霉素药物筛选后,对富集到的细胞进行基因组检测。结果显示本系统能够对猪PK15细胞中的ApoE基因进行有效的敲除,其敲除效率分别为40%、53.3%。试验结果可为ApoE敲除猪动物模型的构建提供理论依据。