氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调控

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(E.coli TopA)属于I型拓扑异构酶,在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程中发挥关键作用。E.coli TopA不仅能结合锌,还可以结合铁。细胞内过量铁可与锌竞争,通过与锌指结构域结合减弱其DNA结合能力和改变蛋白质空间构象,从而抑制TopA拓扑异构酶活性。然而,铁结合形式TopA的氧化还原特性以及氧化还原条件对其活性的影响仍不清楚。本研究通过紫外分光光谱和体外DNA拓扑异构酶活性分析,发现体外纯化得到的铁结合形式的TopA呈氧化状态,能够被二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠还原,原本氧化状态下无活性的TopA在还原条件下,可恢复其拓扑异构酶活性。当还原剂被去除后,铁结合的TopA在空气中能够重新被氧化,且其活性重新受到抑制。这说明,氧化还原条件对铁结合的TopA功能具有可逆调节作用。通过金属-蛋白体外结合实验进一步发现,无金属结合的TopA蛋白(apo-TopA)在无氧条件下,与Fe^(2+)和Fe^(3+)均能结合,但与Fe^(2+)结合能力较弱,并且TopA结合的Fe^(3+)被还原成Fe^(2+)后,结合力显著下降,能够被铁螯合指示剂菲咯嗪快速捕获。此外,蛋白质内源性荧光光谱分析实验表明,铁结合的TopA在氧化还原的不同状态时,其在330 nm左右的荧光值有显著差异。这提示,氧化还原条件可能通过影响铁离子与TopA的结合状态,引起蛋白质空间构象改变,从而对TopA的拓扑异构酶活性进行调节。此研究表明,铁结合TopA的拓扑异构酶活性会受到细胞内氧化还原信号的可逆调控,也提示I型拓扑异构酶可能是细胞铁超载通过氧化损伤引起细胞功能障碍(或铁死亡)的靶点之一。

紫草素对DNA拓扑异构酶Ⅰ活性的抑制作用和诱导人白血病K562细胞的凋亡(英文)

目的 :研究紫草素对DNA拓扑异构酶I催化活性和K5 6 2白血病细胞凋亡的影响。方法 :从K5 6 2白血病细胞提取拓扑异构酶I,通过DNA解螺旋试验评价该药对拓扑异构酶I催化活性的抑制作用。用MTT法测定了该药对K5 6 2白血病细胞增殖的抑制作用。应用流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳观察了该药对细胞凋亡的诱导作用。结果 :紫草素可显著抑制拓扑异构酶I的解螺旋活性 (IC50 =75 0 μmol/L)。该药能显著抑制K5 6 2的细胞增殖 ,并随剂量增大而抑制作用增强。紫草素 0 3～ 3μmol/L对K5 6 2细胞作用 2 4h后 ,其凋亡率为 2 0 %～ 70 %。琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA“lad der”。结论 :紫草素显著抑制拓扑异构酶I的催化活性 ,并能诱导K5 6

9-硝基喜树碱衍生物的合成及体外抗肿瘤活性

目的寻找高效低毒的9-硝基喜树碱类抗肿瘤新化合物。方法设计合成了7个9-硝基喜树碱季氨盐类衍生物,经1H-NMR,IR,MS分析确证化合物的结构,利用MTT法考察了这些化合物的体外抑制肿瘤细胞活性,并通过分子生物学方法评价了这些化合物的拓扑异构酶Ⅰ抑制活性。结果7个化合物的体外细胞毒活性都低于喜树碱和topotecan,其中化合物7,9,11的细胞毒活性与氟尿嘧啶相似。化合物7,9,10,12显示了较好的拓扑异构酶Ⅰ抑制活性。结论该类水溶的9-硝基喜树碱衍生物的抗肿瘤活性值得进一步研究。

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ结合重金属的特性及功能影响

【背景】大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(Escherichia coli topoisomerase I,E.coli TopA)在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程发挥关键作用。研究表明E.coli TopA只有结合锌离子才具有活性,然而E.coli TopA能否结合其他金属离子尤其是重金属离子,以及结合其他金属后是否具有活性,目前仍不清楚。【目的】探究大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是否结合环境中常见重金属离子,研究重金属离子结合E.coli TopA蛋白后对其活性的影响。【方法】在分别添加有锌、钴、镍、镉、铁、汞、砷、铬、铅、铜离子的M9基础培养中表达、纯化出E.coli TopA蛋白,并对纯化得到的蛋白用电感耦合等离子体质谱仪进行相应金属离子含量的测定;利用表达E.coli TopA锌指结构的突变体蛋白鉴定重金属离子的结合位点;通过体外超螺旋DNA松弛实验测定不同金属结合E.coli TopA的拓扑异构酶活性;通过测定蛋白内源性荧光推测不同金属结合E.coli TopA的空间构象差异。【结果】E.coli TopA在体内除了能结合锌和铁之外,还能够结合钴、镍、镉3种离子,但是不能结合汞、砷、铬、铅、铜离子。钴、镍、镉结合形式的E.coli TopA,每个蛋白分子最多可以结合3个相应的金属离子,他们与TopA蛋白的结合位点也是位于3个锌指结构域,而且每个锌指结构域结合1个金属离子。此外,E.coli TopA结合钴、镍、镉离子后,其DNA拓扑异构酶活性并未受到影响,可能是由于钴、镍、镉离子结合形式的E.coli TopA蛋白,其空间构象与锌结合形式相比并未发生显著变化。【结论】由于DNA拓扑异构酶在维持细胞正常生理功能中发挥关键作用,研究表明E.coli TopA的功能不会受到常见重金属的干扰(不结合或者结合后活性无影响),这也有可能是大肠杆菌在进化过程中产生的对抗环境中重金属离子毒害作用的一种自我保护和耐受机制,具有重要的生理意义。

Nutritional Composition and Topoisomerase Inhibitor Activity of Ethnomedicinal Marine Mollusk Nerita albicilla

DNA topoisomerases （topo） I and II are molecular targets of several potent anticancer agents. Thus, inhibitors of these enzymes are potential candidates for anticancer development. Traditionally, Nerita albicilla had been used in Kei Island, Southern Maluku, Indonesia to treat liver disease including cancer. The paper reports on the chemical composition ofNerita albicilla and its topo I inhibitor ofhexane, ethyl acetate and methanol extracts. Topoisomerase-I inhibitor activity was determined using the method reported by TopoGEN. The proximate analysis described that Nerita albicilla dried powder contained 12.45% ± 0.05% moisture; 9.17% ± 0.03% ash; 62.05% ± 0.10% protein; 5.58% ± 0.08% fat; 6.60% ± 0.02% crude fiber and 4.15% ± 0.24% carbohydrate （by difference）. Furthermore, the protein consisted of 11 essential amino acids and six non-essential amino acids. It contained significant amount of branched-chain amino acids （BCAA） valine, leucine, isoleucine （a total of 187.8 mg g-1 protein） and lower content of aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine and histidine （a total of 111.26 mg .g-1 protein）. The protein score was 92.2. The yield of hexane, ethyl acetate and methanol extracts ofNerita albicilla were 2.05% ± 0.05%, 1.56% ± 0.06% and 6.99% ± 0.14%, respectively. All extracts showed topoisomerase-I inhibitor activities. Minimum inhibitory concentration （MIC） of methanol extract was 2.50 ug mL-1. Chemical screening of the extracts showed that they contained steroidal and alkaloid compounds. The investigation revealed that Nerita albicilla contains active compounds that could be potential for nutraceutical or pharmaceutical development.