拟南芥液泡型H^(+)-ATP酶E1亚基编码基因AtTUF的研究进展

液泡型H^(+)-ATP酶(Vacuolar-H+-ATPase,V-ATP酶,VHA)是存在于所有真核生物中的一类质子泵,主要存在于植物液泡膜、高尔基体及胞内体等内膜系统上,在维持真核细胞内膜区室的pH稳态过程中发挥着重要作用.V-ATP酶是一种多亚基蛋白复合体,由亲水的头部V_(1)和疏水的基部V_(0)两个区域组成,V_(1)位于膜外胞质区,呈球茎状,由A~H 8个亚基组成,主要负责ATP的水解;V_(0)整合于膜中,由a、c、c''、d、e 5个亚基组成,主要负责质子易位.在拟南芥中,V-ATP酶的大多数亚基由包含2~5个成员的小基因家族编码,其中VHA的E亚基由3个具有差异表达的同工型基因编码,在种子发育期间,VHA-E1是胚胎发生过程中的主要同工型,VHA-E2具有花粉特异性,而VHA-E3主要在胚乳和周围的母体组织中表达.VHA-E1亚基由AtTUF基因(又被称为TUFF,EMB2448,VHA-E1,VHAE1,基因号AT4G11150)编码,与跨液泡膜的物质运输密切相关,在体细胞发育过程中对维持功能性分泌系统及植物对各种非生物胁迫的响应过程中均起着重要作用.论文综述了拟南芥中AtTUF的研究进展,以期为相关领域的研究提供参考.

过表达AtVIP1基因增强转基因拟南芥对铜胁迫的抗性

铜对植物生长至关重要,过量会导致生物量降低。AtVIP1属于拟南芥bZIP家族,具有淀粉积累、渗透信号传导和促进农杆菌转化等作用。转录因子VIP1在植物响应非生物胁迫方面已有研究报道,但与铜胁迫相关的研究还未见报道。为明确AtVIP1基因过表达植株在响应铜胁迫过程中的作用,向1/2 MS固体培养基中加入50μM的铜离子,观察AtVIP1基因过表达植株在胁迫后对种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明:在铜胁迫下,AtVIP1基因过表达可减轻对种子萌发的抑制,缓解幼苗受到的伤害,提高SOD、POD和CAT等抗性酶的活性,减少MDA含量,降低细胞膜的通透性,增强拟南芥对铜胁迫的抗性。综上,研究结果为深入解析植物响应铜胁迫的分子调控网络提供一定的理论依据。

拟南芥ABF1及ABI5在不同处理下的表达模式分析

本文以7d龄哥伦比亚野生型拟南芥为研究对象,探究在不同NaCl、山梨醇、ABA、蔗糖处理下ABF1及ABI5的表达模式。qRT-PCR结果表明,与对照组相比,ABF1及ABI5的mRNA含量随NaCl浓度的增高逐渐降低,100mM及150mM NaCl处理下,ABF1的mRNA含量降至对照组的0.11和0.08倍,而ABI5的mRNA含量分别降至对照组的0.01和0.02倍;50mM的山梨醇处理下,ABF1及ABI5的mRNA含量增至对照组的3.7和1.32倍,100mM和150mM的山梨醇处理下,ABF1的mRNA含量分别增至3.32和1.72倍,ABI5的mRNA含量分别增至2.87和1.42倍;在50mM的蔗糖处理下,ABF1的mRNA含量降至对照组的0.91倍,此时ABI5的mRNA含量增至1.32倍,100mM和150mM的蔗糖处理下,ABF1的mRNA含量降至对照组0.57和0.15倍,ABI5的mRNA含量降至0.67和0.38倍。在10、30及50μM ABA处理下,ABF1的mRNA含量分别增至对照组的5.32、4.14及4.6倍,ABI5的mRNA含量分别增至8.53、7.2及11.5倍;在4℃和16℃处理下,ABF1的mRNA含量为对照组的0.86和3.02倍,而ABI5的mRNA含量为2.92和1.75倍。这些结果均表明ABF1及ABI5响应高盐、低温和ABA等过程。

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。

功能丧失突变透示ATS1对拟南芥种子发育的非必需作用

【目的】甘油脂是生物膜的重要组成成分,植物中的ATS1催化甘油脂原核合成途径的第1步酰化反应,但目前ATS1在植物正常生长发育中的功能并不完全清楚。本研究运用反向遗传学手段剖析ATS1功能丧失对植物生长发育的影响。【方法】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建拟南芥Arabidopsis thaliana ATS1基因功能丧失型突变体,并比较分析突变体与野生型在整个生育期的表型差异。【结果】分子鉴定显示:多个突变体中ATS1基因的第1个外显子碱基数呈非3的倍数的缺失或插入,从而导致移码突变或翻译提前终止。这些突变体的叶片中多不饱和脂肪酸C16:3的含量急剧下降,而C18:3含量则显著增加。相随的表型分析显示:ATS1基因功能丧失有时会使叶片略显黄色,但对种子发育未产生可见影响。【结论】在正常生长条件下,ATS1并非拟南芥种子发育所必需的。

高粱深根基因SbDRO1的克隆及功能验证

干旱严重影响作物的生长和产量,根系的结构及分布情况是植物响应干旱胁迫的关键因素。高粱作为一种耐旱性较强的作物,挖掘其抗旱相关基因对于作物抗旱改良具有重要的作用。本研究在高粱中克隆得到深根基因SbDRO1,对其进行生物信息学分析,并在拟南芥中进行功能验证。结果表明,SbDRO1基因CDS全长759 bp,编码252个氨基酸;在拟南芥中过表达SbDRO1能够显著提高拟南芥在干旱条件下的存活率,且转基因拟南芥的根系相对野生型明显发达。进一步研究发现,涉及生长素合成、极性运输以及抗逆相关基因的表达量在转基因拟南芥中显著提高,这或许是SbDRO1基因提高转基因拟南芥抗旱性的主要分子机理。本研究结果可为农作物抗旱改良提供潜在的基因资源。

拟南芥逆境响应蛋白SEP1的初步研究

为了研究拟南芥逆境响应蛋白SEP1的生物学功能,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了SEP1基因缺失的拟南芥突变体sep1-1.和从诺丁汉拟南芥种子库(NASC)购买的SEP1基因敲降突变体sep1-2一样,sep1-1在正常条件下与野生型没有明显差异.但是在1200μmol photos∙m^(-2)∙s^(-1)高光处理8 h后,两个突变体新生叶片的叶绿体光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大量子产量(Fv/Fm)和野生型(WT)相比有着不同程度的下调,说明PSⅡ的活性降低.亚细胞和叶绿体精细定位结果表明,SEP1是叶绿体基质类囊体膜蛋白.通过蓝绿温和凝胶电泳(BN-PAGE)和二向(2D)SDS-PAGE/蛋白免疫印迹分析发现:SEP1与某些未知蛋白结合形成一个分子质量约为100 ku的复合物,它们可能共同参与了PSⅡ的组装或修复.

拟南芥细胞膜质子泵对硝酸盐吸收利用的影响

[目的]硝态氮(NO_(3)^(-)-N)是多数植物吸收利用的主要氮素形态之一,NO_(3)^(-)-N的跨膜运输需要耦合质子共转运,质子运转需要细胞膜上的质子泵提供质子驱动力。本研究通过分析拟南芥细胞膜质子泵AHA1和AHA2对硝态氮吸收的信号网络,以明确硝态氮吸收过程中的分子调控机制。[方法]以野生型Col-0、质子泵基因突变体aha1-9、aha2-5以及恢复系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5为试验材料,在不同NO_(3)^(-)-N浓度(1、10和20mmol/L)培养基上培养10天,观察其表型,记录根系生长以及生物量变化,测定根系细胞膜质子泵蛋白及其磷酸化水平变化,检测根系中参与NO_(3)^(-)-N响应与转运相关基因(NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4和NLP7)和生长素响应与转运相关基因(ARF11、IAA6、PIN7和SAUR57)的相对表达量。[结果]20 mmol/L NO_(3)^(-)-N处理下各材料之间的生长无显著差异。在1和10 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下,与野生型相比,aha1-9和aha2-5的主根长度、侧根数量、根部和地上部生物量均显著降低。1 mmol/L NO_(3)^(-)-N时,aha1-9的上述指标与野生型的差异显著大于aha2-5。恢复系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5在各个NO_(3)^(-)-N供应水平下均与野生型差异不显著。通过分离根系细胞膜发现,在1、10 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下,相比野生型,aha1-9和aha2-5的细胞膜质子泵蛋白水平分别降低了68%、19%和36%、53%,质子泵蛋白磷酸化水平分别降低了83%、43%和16%、42%;在20 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下,aha1-9和aha2-5的质子泵蛋白水平与野生型差异不显著,但磷酸化水平显著降低。通过RT-qPCR测定发现,在1 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下,aha1-9、aha2-5根系中的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NLP7表达量相比野生型显著下调,10和20 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下均没有显著差异。此外,在1和10 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下aha1-9、aha2-5中的ARF11、IAA6、PIN7和SAUR57表达量显著上调,然而在20 mmol/L NO_(3)^(-)-N条件下其表达量没有显著差异。[结论]低氮条件下,敲除细胞膜质子泵基因不仅降低其自身蛋白的合成和磷酸化水平,同时也影响硝酸盐转运蛋白基因和生长素相关基因的表达,进而抑制植物的生长。

拟南芥线粒体蛋白突变体ssr1-2表型的详细鉴定与分析

SSR1在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中编码一个线粒体蛋白,为深入了解SSR1基因在植物生长发育和逆境应答中的作用,以ssr1-2及其抑制子突变体EMS143和EMS145为材料,对其根和地上部分的生长,及其对脯氨酸的敏感性和铁稳态进行跟踪分析,并利用拟南芥幼苗嫁接技术分析了ssr1-2短根表型对地上部分生长的影响。结果表明:ssr1-2主根长变短,根系的形态与须根系类似。地上部分也小于野生型,但出现得晚于根短表型。嫁接试验结果表明,突变体的根能限制野生型的地上部分生长,反之突变体的地上部分也能影响野生型的根,但前者的作用更大。ssr1-2在种子萌发、根长和叶绿素含量等指标上表现出对脯氨酸的超敏感表型。此外,ssr1-2对铁营养不敏感,即铁盐对其生长的促进作用显著小于WS野生型,说明其利用铁的能力显著下降。这些结果表明SSR1可能通过影响铁营养利用参与拟南芥根生长的调控,暗示线粒体铁元素利用机制的损伤可能是脯氨酸对植物生长发育抑制作用加强的原因之一。

灯盏花叶片数调控基因磷酸蛋白酶1的克隆与功能分析

【目的】探究灯盏花叶片数相关基因磷酸蛋白酶1(EbPP1)的功能,为揭示灯盏花叶片数目和开花时间分子机理奠定基础。【方法】从灯盏花叶片克隆EbPP1基因,将其构建至植物过表达载体RP101。用蘸花法侵染刚抽薹拟南芥植株进行异源表达,通过筛选获得若干株T_(1)、T_(2)、T_(3)代拟南芥阳性植株。最后统计T_(3)代阳性植株叶片数目和开花时间,通过实时荧光定量(RT-qPCR)检测EbPP1表达量,并测定拟南芥植株内源激素含量。【结果】成功克隆全长EbPP1基因,并构建该基因的重组过表达载体RP101-GFP-EbPP1。在拟南芥中实现稳定的遗传转化,于T_(3)代中获得24株阳性EbPP1转基因植株,并对T_(3)代阳性植株进行实时荧光定量分析,RT-qPCR结果显示转基因拟南芥中EbPP1基因过量表达,其表达量从野生型的1.034增加至136.330;转基因拟南芥在表型上呈现出叶片数增多、开花时间延迟的特征;通过LC-MS定量测定植株内源激素含量显示,T_(3)代转基因拟南芥中吲哚-3-甲酸(ICA)和赤霉素24(GA24)等多种激素的含量明显高于野生型,其中生长素前体物质L-色氨酸(TRP)尤为显著,达到野生型的3倍。【结论】本研究成功在拟南芥植株中异源表达EbPP1基因,与野生型相比,转基因拟南芥中叶片数增多,EbPP1基因表达量增高,内源激素含量升高。表明EbPP1可能通过调控植物激素水平,进而影响灯盏花叶片数目和开花时间。本研究为进一步解析灯盏花叶片数目发育相关机制和开花分子机理奠定基础,也为选育高品质灯盏花新品种提供一定遗传基础。

过表达AtAUR1对UV-B胁迫下根尖细胞周期调控的影响

随着南北两极臭氧层空洞的持续增大,UV-B辐射对整个地球的生态系统造成的危机不断增强.植物受其特殊生活方式的影响,更容易遭受增强UV-B辐射的影响.UV-B辐射作为一种非生物压力信号会造成植物细胞DNA的损伤从而显著抑制植物生长,严重时甚至会导致植物的死亡.Aurora激酶作为调控有丝分裂的重要蛋白,在有丝分裂过程中参与了染色体的定位、分离以及胞质分裂等过程,实验室之前的研究结果表明过表达AUR1可以缓解UV-B辐射导致的损伤.研究以模式植物拟南芥为材料,通过有性杂交的方法获得含CYCB1;1-GUS标签的拟南芥AUR1过表达株系.通过GUS染色和RT-qPCR的方法对获得的转基因株系在UV-B处理后CYCB1;1的组织表达模式进行了分析,实验结果证明了过表达AUR1可以上调植物根尖细胞中CYCB1;1的基因表达,UV-B辐射处理后的染色结果进一步证明了AUR1参与了UV-B辐射后根尖有丝分裂周期的调控,为揭示过表达AUR1对根尖有丝分裂周期调控的影响提供了一定的理论基础.

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达。采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S∷AtICE1植物表达载体。通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导入烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明AtI-CE1基因可以提高低温敏感作物的耐寒性。

海岛棉GbHyPRP1克隆及其转基因拟南芥抗黄萎病验证

在对黄萎病菌胁迫处理的海岛棉Pima 90-53根组织全长c DNA文库分析中,筛选到一个与黄萎病胁迫相关的杂合富含脯氨酸蛋白(hybrid proline-rich protein)基因,将其命名为Gb Hy PRP1。该基因c DNA序列全长1747 bp,开放阅读框945 bp,编码一个由314个氨基酸残基组成的蛋白,包含信号肽、N端富含脯氨酸域及C端Pollen Ole e I域。同源序列分析显示,Gb Hy PRP1与来自雷蒙德氏棉、陆地棉和亚洲棉的Hy PRP1蛋白序列相似性最高,分别为95.95%、93.87%和91.34%。q RT-PCR分析结果显示,受黄萎病菌胁迫后海岛棉根部Gb Hy PRP1表达显著下调。将Gb Hy PRP1基因克隆至植物超表达载体,农杆菌介导转化拟南芥获得转基因植株。病指统计分析表明Gb Hy PRP1过量表达显著降低了拟南芥对黄萎病的抗性。据此推测Gb Hy PRP1参与棉花抗黄萎病,可能是一个重要的负调控因子。

IQM1基因过量表达对拟南芥气孔运动及根系生长的影响

拟南芥钙调素结合蛋白IQM家族共有6个成员,已证实IQM1是一个不依赖Ca2+的钙调素结合蛋白,其功能缺失突变体iqm1表现气孔开度小和根短的表型,而且突变体气孔开度并不因光、暗、脱落酸等诱导而变大或变小。该实验构建了IQM1基因双元表达载体并转化拟南芥,通过分子筛选及IQM1表达量分析,获得了IQM1基因过量表达植株。表型分析发现,IQM1过量表达植株在光诱导气孔开放处理后气孔开放度明显比野生型和iqm1-1增大,在暗诱导气孔关闭处理后气孔开度则显著变小;IQM1过量表达植株的主根比野生型和iqm1-1长,侧根数量比野生型和iqm1-1多,但IQM1过量表达对植株的生长形态、抽薹期、开花期及座果等方面却没有明显影响。研究表明,IQM1基因在植物气孔运动及根系生长中起着重要作用。

AhHDA1异源表达影响拟南芥植株干旱性

将花生组蛋白去乙酰化酶1基因(Arachis hygogaea histone deacetylase 1,AhHDA1)转化拟南芥野生型Col-0和突变体had6,对获得的纯合转基因植株进行抗旱性分析,并对ABA合成及相关响应基因表达进行检测.结果表明:AhHDA1蛋白定位于细胞核,在干旱条件下,与hda6突变体比较,p35S%HDA1/hda6拟南芥植株的叶片相对含水量降低,气孔开度增大,干旱存活率降低,基本回复了Col的表型;体内ABA合成关键酶基因At NCED3和ABA信号途径重要转录因子At ABF3基因的表达降低,但RD29A基因表达提高.而p35S%HDA1/Col较p35S%HDA1/hda6和Col的抗旱性关键生理指标降低更加显著.说明hda6突变体表型回复确实由于外源AhHDA1的表达引起的,推测AhHDA1影响植物抗旱性与ABA的合成与信号通路相关.

拟南芥AtNHX1基因克隆和cre(lox)植物表达载体构建

从拟南芥叶片提取总RNA,经反转录得到cDNA。根据Genbank数据库中已登记的拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1的核苷酸序列设计并合成了1对克隆引物,通过PCR方法从cDNA中扩增出AtNHX1基因片段,将该目的片段克隆至pGEM-TEazy载体。通过酶切,从pGEM-TEazy载体上切下目的基因片段,替换pX6-GFP载体中的GFP基因,构建了AtNHX1基因cre/lox植物表达载体。

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建

NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。该文以DNA PCR扩增的方法,从拟南芥基因组DNA中克隆出NPR1基因,通过序列分析,所克隆的 NPR1 基因与报道的基因序列完全一致。将其构建成植物表达载体,为今后植物抗病基因工程的开展奠定了基础。

拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价

RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基,是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了拟南芥RBCS-1A受光调节的表达模式,结果表明,AtRBCS-1A表达受到光的诱导,同时具有组织表达特异性;运用生物信息学手段分析发现,该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件;采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1691bp的AtRBCS-1A启动子片段,将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥,对获得的转基因植株进行GUS染色,结果显示,AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明,AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行,具有重要应用价值。

拟南芥AtCDPK1基因克隆与转化马铃薯的研究

以野生拟南芥生态型(Col-0)为材料,利用PCR和DNA重组技术,克隆了拟南芥钙依赖蛋白激酶基因(AtCDPK1)。AtCDPK1基因全长为2 269bp,碱基序列与已知基因At1g18890完全一致。构建AtCDPK1基因的植物表达载体pCHF3-CDPK1,并利用农杆菌介导法将pCHF3-CDPK1转入马铃薯品种‘费乌瑞它’的脱毒试管微型薯中,经筛选与植株再生,共获得50个抗性再生植株。PCR检测显示,有36个植株基因组中含有AtCDPK1基因。RT-PCR分析证实,AtCDPK1基因在这些马铃薯植株的基因组中均能正常转录表达。这一结果为进一步开展AtCDPK1基因功能分析及转基因抗旱马铃薯新品种选育研究奠定了基础。

东莞大蕉超表达拟南芥CBF1基因及其抗寒性检测

【目的】研究超表达拟南芥CBF1基因(AtCBF1)对大蕉抗寒性的影响,为从大蕉克隆抗寒相关基因奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法转化东莞大蕉的胚性细胞悬浮系,获得转AtCBF1基因的大蕉植株;利用GUS组织染色、PCR、RT-PCR以及RT-qPCR对转基因植株进行鉴定;比较低温处理后的转基因株系和对照的冷害特征以及超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量等生理生化指标,鉴定转基因大蕉植株的抗寒能力。【结果】试验共获得6个抗性再生转化系。GUS组织染色结果表明,除T1外,其余均为阳性;PCR鉴定结果表明,AtCBF1在6个抗性再生转化系均为阳性,而GUS基因在T1转化系中没有检测出;RT-PCR结果表明,AtCBF1在6个转化系均得到表达,对T1、T2和T3 3个转化系进行RT-qPCR检测发现,AtCBF1基因在3个转基因株系表达水平存在差异;在低温处理下,转基因植株的叶片相对电导率、MDA的累积都低于非转基因植株,而SOD总活性高于对照;低温处理条件下,转基因植株叶片的冷害症状明显轻于对照。【结论】AtCBF1在大蕉中超表达,具有增强大蕉SOD活性,降低因低温导致的MDA含量和离子渗漏率,缓解质膜过氧程度,进而改善大蕉植株抗低温胁迫的能力。