拟微球藻不溶性膳食纤维提取工艺优化及其理化性质研究

以拟微球藻藻粉为原料,采用超声辅助碱法提取不溶性膳食纤维(IDF),并对其理化特性进行研究。结果表明:最优提取条件为NaOH浓度1.8 mol/L、提取时间45 min、料液比1∶30(g/mL)、提取温度55℃,在此条件下藻粉IDF得率和纯度分别达到24.98%±0.93%和86.12%±0.25%。藻粉IDF理化指标分析显示,其持水力为(6.65±0.09)g/g、膨胀力为(6.25±0.18)mL/g、持油力为(1.90±0.03)g/g。体外吸附试验结果表明,藻粉IDF对NO_(2)^(-)、葡萄糖、胆固醇、胆酸钠均表现出较强的吸附能力。傅里叶红外光谱分析结果表明,藻粉IDF具有典型的多糖结构。

氮源和N/P对眼点拟微球藻的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响

报道了NaNO3,NH4Cl和NH4NO3 3种氮源及N/P对海洋微藻眼点拟微球藻(Nannochloropsisoculata)的生长、总脂含量和脂肪酸组成的影响。结果表明 ,N/P从10增加到90 ,对细胞生长的影响不大 ,总脂含量最终都稳定在干重的20 %左右。16∶0、16∶1n 9和20∶5n 3 (EPA)是脂肪酸的主要组分 ,三者之和占总脂肪酸的70 %～80 %。在培养基N/P>20时 ,20∶5n 3和PUFA占总脂肪酸的比例接近30 %和35 %。在3种氮源中 ,使用NaNO3 可获得更高的生长速率 ,并在相对较低的N/P下 (N/P=54)时获得约30 %的EPA ,故NaNO3 是眼点拟微球藻生长、合成和积累EPA的最佳氮源。将培养基中所有营养盐增加4倍 ,EPA含量可提高到35 % ,说明富含氮、磷的培养基可使细胞始终保持旺盛生长、富含EPA的状态 ,这也是该种微藻大规模培养中高产EPA的关键措施。

三种抑制剂对眼点拟微球藻的生长及脂肪酸组成的影响

研究了 DCMU、氟哒酮及亚油酸对眼点拟微球藻的生长、总脂含量及不饱和脂肪酸组成的影响。结果表明 :(1)当 DCMU的浓度在 0 .8μmol/ L以上时 ,眼点拟微球藻的生长抑制率达80 % ,其总脂占干重的百分含量减少了近 30 % ;在 1.0 μmol/ L 时 ,EPA占其总脂肪酸的相对百分含量增加了 10 8.6 1%。 (2 )当氟哒酮的浓度在 8.0μmol/ L以上时 ,眼点拟微球藻的生长抑制率为82 .9% ,其总脂占干重的百分含量下降了 2 1% ,而 EPA占其总脂肪酸的相对百分含量增加了6 0 %。(3)当亚油酸的最终浓度在 4 0 0 μmol/ L 以上时 ,眼点拟微球藻的抑制率达 6 4 %以上 ;大于30 0 μmol/ L、4 0 0 μmol/ L 时 ,EPA占其总脂的相对百分含量在 4 .77%以下 ;在 5 0 μmol/ L 以下时 ,EPA占其总脂肪酸的相对百分含量从对照组的 2 0 .96 %下降到 19.4 9%以下。结果表明 ,眼点拟微球藻在养殖中 ,当生物量增加到一定的程度时 ,可以用加入一定浓度的 DCMU或氟哒酮的方法来大幅度提高 EPA的含量。

盐度及其调节方式对眼点拟微球藻的生长和EPA积累的影响

本文研究了盐度对海产眼点拟微球藻的生长和EPA积累的影响,同时比较了天然海水、粗海盐和NaCl三种物质在调节培养基盐度、影响藻细胞生长和EPA积累方面的作用,结果表明:盐度处于14.5‰～33.5‰之间对EPA的含量没有显著影响,但对细胞比生长速率的影响更为显著。藻细胞生长和EPA积累的最适盐度范围在27.0‰～29.0‰。用NaCl实现海水中的盐度不能有效促进细胞的生长和EPA积累,而用粗海盐实现海水中的盐度能发挥与海水基本相同的作用。

富含EPA的海洋微藻眼点拟微球藻的大规模培养

采用“随机设计”软件优化了海洋微藻眼点拟微球藻 (Nannochloropsisoculata)的工业培养基 ,细胞在配方 1中的EPA含量占总脂肪酸的 4 0 %以上 ,平均比生长速率高达 0 .32d- 1。 1999年 10月间在 83.5m2 户外池中大规模获得生物量的平均面积产率为 1.0 9g/m2 ·d ,藻粉中含有 4 9.5 0 %的蛋白质、2 0 .30 %的总脂和3.0 0 %的EPA。 2 0 0 0年 8月 ,在 6 .12m2 、2 8.0 2m2 和露天 83.5m2 跑道池中采用耐高温生产藻种 ,生物量面积产率分别为 5 .4 4、9.96和 7.6 6g /m2 ·d ,藻粉中含有 2 .5 0 %的EPA。这表明富含EPA的眼点拟微球藻的工业化生产是完全可行的 。

Fe对眼点拟微球藻的生长和脂肪酸组成的影响

研究了铁对眼点拟微球藻（Nannochloropsis oculata）的生长和脂肪酸组成的影响。结果表明：Fe^2＋浓度在0～0．5mmol／L的范围内，细胞比增长速率随Fe^2＋浓度的升高而降低。与对照组相比，随着Fe^2＋浓度的升高，细胞中主要的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例有所降低，而多不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例则有较大的提高。另外，在一定范围内（0～0．3mmol／L），Fe^2＋浓度的升高则会促使细胞内积累二十碳五烯酸（EPA）。细胞生长和EPA积累的最适Fe^2＋浓度是0．05mmol／L，在这一浓度下细胞比增长速率为0．236±0．020d^-1，细胞中EPA质量分数比对照组提高约24％。

一种提取眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)DNA的简便方法

用氯化锂法从眼点拟微球藻 (Nannochloropisisoculata)中提取DNA并对其提取条件进行了优化。新鲜藻细胞在提取液 (0.6mol/LLiCl,0.8%Sakosyl,20mmol/LEDTA(pH8.0) ,0.4%PVP,10mmol/LTris HCl(pH8.0) ,5% β 巯基乙醇 )中经过55℃温育30min,每mg鲜藻可提取20～40ngDNA ,提取的DNA分子量在23kb左右 ,可用于PCR、限制性酶切等。

迦得拟微球藻在不同硝酸钾浓度下的生长和生理生化特征

迦得拟微球藻(Nannochloropsisgaditana)具有较高的开发价值,但对于其活性物质定向积累的研究相对较少。本文以迦得拟微球藻为研究对象,设置3.0、5.0、7.5和14.9mmol/L (对照组,ASW培养基的硝酸钾浓度)四种硝酸钾组,探究氮素水平调控迦得拟微球藻总脂、多糖、可溶性蛋白和多不饱和脂肪酸等物质定向积累的可行性,以及此过程藻细胞的光合生理响应规律。结果表明:与对照组相比,硝酸钾浓度降低,迦得拟微球藻的生物量降低、总脂含量增加、可溶性蛋白质含量和多糖含量降低,然而其总脂、多糖与可溶性蛋白产率的最大值却在对照组条件下获得,分别为0.150、0.170和0.053g/(L·d);与对照组相比,3.0、5.0和7.5mmol/L处理组的C20:5相对含量分别降低73.1%、49.1%和23.9%;迦得拟微球藻的主要色素(堇菜黄素、无隔藻黄素、β-胡萝卜素、叶绿素a)随氮浓度降低呈减少趋势;PSⅡ最大光量子产量(Fv/Fm)、相对电子传递效率(rETR)和光合放氧速率随氮浓度降低而显著降低。综上所述,调控氮浓度可以实现迦得拟微球藻总脂、可溶性蛋白、多糖和C20:5的定向积累,但上述物质的产率却受到生物质浓度的影响,14.9mmol/L氮浓度条件下高光合效率是迦得拟微球藻获得较高活性物质产率的主要原因。

酶菌协同处理对微拟球藻营养功能成分及生物活性的影响

为提高微拟球藻开发利用价值,本文开展了酶菌协同处理对微拟球藻营养功能成分及生物活性影响的研究。采用木瓜蛋白酶酶解微拟球藻,利用单因素和响应面试验获得其最佳酶解工艺,随后通过益生菌发酵酶解基质,研究发酵前后总酚、多肽和黄酮含量以及体外抗氧化和降血脂活性的变化,并对发酵后的微拟球藻酶液进行感官评价。结果表明:微拟球藻的最佳酶解工艺为:酶量5.0%、pH8.0、酶解时间4.0 h、酶解温度76℃;在此条件下酶解后发酵可有效提高产物中多肽的含量,其中混菌发酵组提高了近1.3倍,总酚含量提高了5.1%,同时总黄酮的含量降低了32.5%;酶菌协同处理显著增强了其抗氧化和胰脂肪酶抑制活性,其中混菌发酵组DPPH自由基清除率提高了1.2倍,胰脂肪酶清除率提高了59.4%。此外,发酵后感官评分显著提升。可见,酶菌协同发酵可显著提高微拟球藻多肽含量、抗氧化活性、降血脂活性及感官特性,为开发功能型发酵产品提供了参考和技术支持。

中性脂含量高的微拟球藻藻株的快速筛选

微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)生长速度快、油脂含量高,已成为生产生物柴油的理想材料。为获得中性脂产率高的藻株,本研究从染色时间和染色浓度两个方面优化了尼罗红染色测定中性脂含量的方法,对不同育种方法得到的75株微拟球藻藻株的产油能力进行了评价。采用优化后的染色条件(尼罗红浓度1 mg/mL,染色时间10 min),测定了第9天微藻的中性脂相对含量及对应的生物量,获得藻株中性脂的相对产率。研究表明,与原始藻株相比,088号转基因藻株相对产率为252.16%,甲基磺酸乙酯(EMS)诱变藻株101号相对产率为259.02%,亚硝基胍(NTG)诱变藻株231号相对产率为323.84%。本研究获得了3株中性脂产率高的微拟球藻藻株,这3株藻株有望应用于生物柴油的生产,研究结果可为高油脂含量微藻的快速筛选提供参考。

脂肪酶催化微拟球藻磷脂制备二十碳五烯酸

在海洋微藻中,微拟球藻是最有潜力合成可食用二十碳五烯酸(EPA)的藻种之一.以富含EPA的微拟球藻磷脂为底物,筛选适合乙醇醇解催化EPA磷脂制备乙酯型EPA的脂肪酶,优化其催化工艺.实验研究表明,固定化酶Novozym 435是最适合催化微拟球藻磷脂制备EPA的生物催化剂.经优化催化条件(酶加量为磷脂量的15%,含水量为底物总量的2%,醇油质量比9∶1,反应温度40℃,反应时间12 h)后,Novozym 435催化磷脂的最高乙酯转化率为98.33%.结果表明,Novozym 435可能是潜在催化微拟球藻磷脂高值化生产开发EPA的脂肪酶.

高效液相色谱法检测微拟球藻中磷脂类化合物含量

建立高效液相色谱法分析微拟球藻磷脂的主要组成与含量。从微拟球藻中提取出磷脂,经ZORBAX RX-SIL柱(4.6 mm×250 mm,5μm)分离,以甲醇-水(87∶13,V∶V)为流动相等度洗脱,流速为1 mL/min,柱温30℃,检测波长205 nm,外标法定量。磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱在浓度0.1~1 mg/mL范围内线性关系良好,相关系数均大于0.996,加标回收率在85%~105%,相对标准偏差(RSD)小于3.1%。高效液相色谱法检测结果表明,微拟球藻磷脂的主要组成磷脂酰肌醇含量为19.32%,磷脂酰乙醇胺含量为18.74%,磷脂酰胆碱含量为11.86%,溶血磷脂酰胆碱含量为3.24%。该方法准确度高,重复性好,适用于微拟球藻中磷脂类化合物含量的测定。

眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻对抗生素的生理响应及去除效应

抗生素的广泛使用对水生生态环境造成潜在风险。为探讨水体残留抗生素对藻类的毒性作用,分别以海洋微藻眼点拟微球藻和淡水微藻近头状伪蹄型藻为对象,探讨三种典型抗生素(红霉素、诺氟沙星和磺胺嘧啶)胁迫下藻类的生理响应和去除效应。实验结果显示,三种抗生素中红霉素的毒性较强。高浓度红霉素对两种藻类生长均起到抑制作用,低浓度红霉素暴露则会刺激藻类生长,眼点拟微球藻和近头状伪蹄型藻的72 h半数最大有效浓度(EC50)分别为6.13 mg/L和27.7μg/L。随着红霉素浓度的增加,两种藻类的光合色素含量显著降低(p<0.05)。藻体内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性也表现出低浓度红霉素暴露时显著增强,高浓度时则显著受到抑制的现象(p<0.05)。实验结果表明所选藻类对诺氟沙星和磺胺嘧啶具有一定的生物去除能力。经144 h暴露后,眼点拟微球藻对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为57%和78.3%,近头状伪蹄型藻在暴露120 h后对诺氟沙星和磺胺嘧啶的去除率分别为51.2%和8.3%。

眼点拟微绿球藻与扁藻在不同接种比例下的竞争

通过对眼点拟微绿球藻和扁藻进行共培养试验,结果表明,在共培养条件下,眼点拟微绿球藻和扁藻的生长速度均受到抑制,即两种藻的最大生长密度均比对照(分别单独培养)有显著降低,而且眼点拟微绿球藻降低的程度要大于扁藻。经计算两种藻的种间竞争系数可知,扁藻的种间竞争能力明显强于眼点拟微绿球藻。

pH对眼点拟微绿球藻的生长、总脂含量及脂肪酸组成的影响

pH对眼点拟微绿球藻(Nannocholoropsisoculata)的生长、总脂含量及脂肪酸组成有明显影响。研究表明 ,眼点拟微绿球藻的生长对pH有较强的适应性 ,在pH6.2～9.8的范围内均能较好的生长 ,但在 pH5.5的条件下生长受到较强的抑制。在不同 pH条件下 ,在同一细胞周期内总脂含量及脂肪酸组成均有相同的变化规律 ,即总脂含量在对数初期略有下降然后逐渐上升 ,在稳定期达到最大值。16∶0,18∶1n9的含量在稳定期显著升高 ,而EPA的含量在稳定期明显下降。在对数初期,藻细胞在pH6.8的条件下含有较高的EPA含量,而在 pH9.8的条件下 。

眼点拟微绿球藻在黑暗胁迫下的超补偿生长响应

采用LRH-GII型光照培养箱培养试验藻种,设置了持续黑暗胁迫(分6个强度处理)和间断黑暗胁迫(分4个模式处理)两项试验,研究了眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)在不同环境胁迫下的生理生态变化和该藻种在黑暗胁迫下的超补偿生长响应情况.两个试验的结果均显示,眼点拟微绿球藻在持续黑暗胁迫和间断胁迫后,均表现出明显的超补偿作用现象.黑暗对眼点拟微绿球藻的生长造成显著抑制,但是适当进行黑暗胁迫以后恢复生长,微藻具有更强的生长繁殖能力,细胞净增率最大可达123%.经SSR测验,不同的胁迫方式、胁迫持续时间和胁迫模式与超补偿现象发生时间及强度密切相关.

培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响

眼点拟微绿球藻（N.oculata）具有生长速度快、含油量高等优点,且其脂肪酸组成中含有大量二十碳五烯酸（EPA）,因此它是微藻生物柴油的良好原料.以眼点拟微绿球藻为对象,研究了培养时间、盐度、pH值等培养条件对眼点拟微绿球藻油脂含量和EPA产率的影响.试验表明：选择稳定5d为眼点拟微绿球藻的最佳采收时间,油脂含量为378.1 mg/g干藻,EPA产率为5.5 mg/（L·d）;当盐度为16.7时,眼点拟微绿球藻的油脂含量和EPA产率均能达到最高,油脂含量为506.0 mg/g干藻,EPA产率为7.37 mg/（L·d）;在适合眼点拟微绿球藻生长的pH值（8.0～10.0）下,保持整个培养过程中pH值为8.0i油脂含量和EPA产率均较高,油脂含量为471.7 mg/g干藻,EPA产率为7.45 mg/（L·d）.

微拟球藻抗生素抗性分析和选择标记筛选

为了筛选到微拟球藻Nannochloropsis oculata的筛选标记,研究了微拟球藻对新霉素(Neomycin)、链霉素(Streptomycin)、潮霉素(Hygromycin)、壮观霉素(Spectinomycin)和博来霉素(Zeocin)的敏感性。每种抗生素都设置液体培养和固体培养实验并且浓度梯度相同。新霉素和链霉素的浓度梯度为:0、100、200、400、600、800μg/ml。潮霉素的浓度梯度为0、25、50、100、125、150μg/ml。壮观霉素浓度梯度为0、40、80、100、150、200μg/ml。博来霉素浓度梯度则为0、0.1、0.2、0.4、0.5、1μg/ml。结果表明,微拟球藻对新霉素、链霉素、潮霉素和壮观霉素不敏感,而对博来霉素高度敏感。在固体培养时,0.5μg/ml博来霉素即可完全抑制微拟球藻生长;在液体培养时,1μg/ml博来霉素即可完全抑制其生长。博来霉素可作为微拟球藻遗传转化的选择抗生素。ble基因为其阳性筛选的选择标记基因。

微拟球藻的水产饵料效果研究

通过人工高密度培养微拟球藻（Nannochloropsis salina），对比研究了该藻作为直接饵料在栉孔扇贝（Chlamys farreri）育苗和间接饵料在牙鲆（Paralichthys olivaceus）育苗中的应用效果。结果表明，微拟球藻生长迅速、细胞颗粒小、富含EPA等不饱和脂肪酸、营养比较全面，同时具有较厚细胞壁的特点。通过不同的光生物反应器和高密度培养技术，可以比较容易地实现微拟球藻的高密度培养，藻液细胞密度维持在5～15亿个／mL的高密度水平，最高达到36亿／mL。藻体叶绿素和类胡萝卜素含量因培养条件不同而有差异，其中每个细胞内的叶绿素含量在8．60×10^-13g±0．65×10^-13g，类胡萝卜素含量在1．45×10^-13g±0．12×10^-13g。作为直接或间接饵料，微拟球藻在不同水产动物培育中的应用效果差异性很大。其中，微拟球藻作为饵料直接投喂栉孔扇贝幼虫，虽可被摄食但不容易消化，造成食物在栉孔扇贝幼苗胃内滞留盈胀，最后出现代谢性饥饿和营养不良现象进一步影响个体生长，该藻在栉孔扇贝幼虫培育中的饵料效果不很理想。相反，利用微拟球藻培育轮虫（Rotifer），然后再将后者投喂牙鲆仔鱼，作为间接饵料微拟球藻不仅大幅提高牙鲆的成活率，同时还明显增加牙鲆的生长速度，是培育仔稚鱼开口饵料轮虫的优质微藻。微拟球藻在不同水产动物育苗中应用效果明显差异的原因，主要在于该藻是否能够被充分消化吸收。因此，有效破碎微拟球藻细胞壁技术和提高消化吸收措施都将推动该藻在水产中的应用。