拟无枝酸菌糖肽类和聚酮类抗生素的遗传信息及生物合成途径的研究进展

拟无枝菌属(Amycolatopsis)是万古霉素和利福霉素等次生代谢产物的菌株,该菌属天然抗生素的分子遗传学已经有了广泛研究。由于抗生素耐药率的上升,寻找新的药物来对抗感染治疗已成为当务之急。了解代谢产物遗传信息的新进展有助于合理地操纵生物合成途径,以便于研发新型抗生素。本文综述了近年来通过Amycolatopsis基因组序列发现的糖肽类和聚酮类抗生素及其生物合成途径方面的成果。

东方拟无枝酸菌糖基转移酶基因gtfE的克隆(英文)

糖基转移酶基因 gtf E位于万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌 (Amycolatopsisorientalis)染色体上。通过 PCR的方法并对PCR反应条件进行了优化 ,扩增得到了较高产量的 PCR产物。PCR产物经酶切回收后克隆到 p Bluscript KS+质粒载体 ,转化E.coli DH5 α感受态细胞 ,筛选得到一阳性克隆。测序后与文献报道的基因序列做同源比较 ,结果仅有两个碱基的差异。

地中海拟无枝酸菌原生质体电融合及其在提高利福霉素SV发酵效价中的应用

对产利福霉素SV的地中海拟无枝酸菌 (Amycolatopsismediterranei)原生质体进行热灭活和紫外灭活标记 ,其热灭活条件为 5 2℃ ,1.5h ,紫外灭活条件为紫外线照射 ( 15W ,2 5cm ,2 70nm) 6 0min。将双灭活标记的原生质体用CRY 3型细胞融合仪进行电融合 ,得出 :成串电流频率 1.5MHz ,电压 5 8V ,成串时间 2 0s ,融合脉冲幅宽 80 μS ,融合电压 5 0 0V ,融合槽间距 0 .5mm时 ,融合率最高为 9.3× 10 -4 。对筛选的融合子产量试验表明 ,5 0 %以上的融合子产量高于出发菌株 ,有明显的正变作用 ,将融合子在利福霉素代谢类似物平板上分离纯化 ,获得了化学效价提高 30 %以上的产量稳定菌株。

东方拟无枝酸菌基因工程菌产新糖肽类化合物的发酵条件优化

目的对产新糖肽类化合物的基因工程菌东方拟无枝酸菌HCCB10167的发酵条件进行优化。方法考察了该工程菌的遗传稳定性,对发酵的主要影响因子接种量、初始pH值、温度、摇瓶装量、转速等进行了单因素试验,确定了最佳培养条件,并用均匀设计试验对其发酵培养基进行了优化。结果该工程菌遗传稳定,优化后的产量较起始条件提高1.8倍。结论工程菌保持了万古霉素类抗生素的生产能力,具有规模化生产的潜能。

在东方拟无枝酸菌中建立I-SceI内切酶介导的无标记敲除系统

目的在东方拟无枝酸菌中建立由I-Sce I介导的无标记高效重组系统。方法首先构建可用于东方拟无枝酸菌的I-Sce I操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hem A2,比较操作盒使用前后获得hem A2基因双交换突变株的效率。结果在没有引入I-Sce I的情况下,随机重组的发生几率仅约2%,而导入后,由于I-Sce I酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90%以上。结论 I-Sce I系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具。

东方拟无枝酸菌中基因AORI_2943的敲除对ECO-0501合成的影响

目的对位于ECO-0501生物合成基因簇内AORI_2943基因进行功能鉴定,进一步解析东方拟无枝酸菌中ECO-0501的生物合成途径。方法通过同源重组和定点整合的方式构建AORI_2943缺失、回补及过表达突变株。高效液相及质谱分析突变株发酵产物的变化,分析AORI_2943在ECO-0501合成中的作用。结果 AORI_2943缺失突变株不产ECO-0501和去甲基ECO-0501,只产生结构上缺失了C5N单位(2-氨基-3-羟基环戊-2-烯酮)的前体物质a和b,发酵液中未检测出C5N单位。对缺失突变株回补后,有少量ECO-0501及去甲基ECO-0501产生,同时仍然有大量前体化合物a和b的积累。在野生菌的基础上过表达AORI_2943,并未明显提高ECO-0501的产量。结论 AORI_2943是ECO-0501合成的关键基因,主要参与了ECO-0501前体化合物C5N单位的合成。

AMETH_3452基因在拟无枝酸菌中的系统发育分析

AMETH_3452基因是拟无枝酸菌(Amycolatopsis)中发现的一个放线菌的保守基因,位于拟无枝酸菌属中的环形基因组中间位置。为进一步探究该基因的序列特征并挖掘该基因的应用潜力,本研究将该基因构建在pET28载体上,在大肠杆菌中进行表达,使用蛋白预测网站进行了二级结构和保守区分析,对其直系同源基因在拟无枝酸菌属进行了系统发育分析。AMETH_3452蛋白在大肠杆菌的上清液中可溶性表达。该基因在拟无枝酸菌属的核酸同源性为79.23%~99.02%,在300~500 bp的序列一致性较高。该蛋白序列共269个氨基酸,作为分子标记在76个拟无枝酸菌中进行系统发育分析后发现,东方拟无枝酸菌分支和甲基拟无枝酸菌分支稳定性高,同时可将东方拟无枝酸菌分支分成AORIS和AMEDS 2个可稳定的分支。以上研究将为AMETH_3452基因作为检测环境、动物或临床上的放线菌或系统发育应用研究提供依据。

拟无枝酸菌ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀的发酵工艺的初步研究

无锡他汀是胆固醇合成途径中限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST 2710)转化产生。文中在摇瓶水平考察了底物浓度、溶氧和剪切力等因素对洛伐他汀(底物)转化为无锡他汀(产物)的影响,并在5 L发酵罐上进行了分批发酵及材料分批发酵研究。摇瓶结果表明,菌株对溶氧要求较高,对剪切力很敏感,底物适宜添加浓度为1 g/L。在5 L发酵罐间歇发酵过程中。在控制溶氧不低于35%.搅拌转速为300r/min,产物产量达到最高,为0.77 g/L左右,发酵周期为80 h,较摇瓶发酵缩短16 h。采用补料发酵工艺后,有效减缓底物抑制,产物产量达到1.83 g/L。是分批发酵的2.4倍。

产利福霉素地中海拟无枝酸菌的电转化条件优化

目的 为了获得较高的地中海拟无枝酸菌的转化率，进行了电转化条件的优化。方法 以大肠埃希菌．拟无枝酸菌穿梭质粒pULVKl-Am为载体，地中海拟无枝酸菌为受体菌，考察了收集菌体时期、细胞壁弱化方式、电击缓冲液和电击参数等因素对转化率的影响。结果 以0．1gg／mL氨苄西林处理细胞，A600为0．7～0．8时收集菌体，用溶菌酶．LiAc-DTT溶液于37℃孵育30min，去离子水作电击缓冲液，7．5kV／cm、25gF、750W下进行电击，转化率最高可达到9．23×104CFU／μg质粒DNA。结论只有将不同机制的3种细胞壁弱化剂组合起来对拟无枝酸菌进行处理时，才能得到较高的转化率。

东方拟无枝酸菌中ECO-0501生物合成基因簇的筛选及其相关调控基因的初步分析

ECO-0501是从东方拟无枝酸菌代谢物中分离到的一种新型线性多烯类化合物,其不但具有良好的抗菌活性,且体内毒性较低,目前处于临床前的开发。本文通过对东方拟无枝酸菌的菌落原位杂交,筛选到4个粘粒克隆NL5B,NL9-3-1,NL3-1C,NL3-3A,可以覆盖整个ECO-0501生物合成簇,并对其中的基因ORF4进行了生物信息学分析,推测其为ECO-0501合成途径中的正调控基因。并通过该基因的过表达,成功地将ECO-0501的产量提高了6倍,为下一步ECO-0501的开发及其调控机制的研究打下基础。

东方拟无枝酸菌HCCB10007内attB位点的人工构建

目的在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率。方法在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码序列插入到东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组中,然后将带有绿色荧光蛋白基因(eGFP)的特异性位点重组质粒pLYGYQ2导入该工程菌中。用于验证整合系统的有效性。结果获得基因组中整合有attB位点的基因工程菌LYGYQA。eGFP基因顺利整合入所构建的attB位点,并且获得了表达。同时发现该系统的整合效率较同源重组效率提高了约3倍。结论本研究不但表明来源于链霉菌的位点特异性整合系统可以成功应用于东方拟无枝酸菌中,也证明绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因用于该菌的研究。

常压室温等离子体诱变选育高产香兰素拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)

采用新型常压室温等离子体射流诱变拟无枝酸菌CCTCC M2011265(Amycolatopsis sp.),在等离子体对菌株致死率为61.71%的条件下,以香兰素产量为指标的正突变率达到17.6%,其中复筛得到遗传稳定性的高产突变株LQ-6,香兰素产量达到6.78 g/L,对前体阿魏酸的摩尔产率为72.14%,比出发菌株提高了21.29%,同时其香兰素合成代谢途径中的关键酶脱乙酰酶活性提高了43.2%,香兰素氧化酶活性降低了38.7%。

细胞色素P450酶对拟无枝酸菌转化洛伐他汀的影响

无锡他汀是胆固醇合成途径中限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)羟基化转化产生,为研究无锡他汀转化过程,本文利用CO差光谱法在摇瓶水平考察了底物浓度、温度、pH值、溶氧等因素对具有羟基化功能的细胞色素P450酶活的变化情况,以及细胞色素P450酶变化对洛伐他汀羟基化过程中的影响。研究表明,细胞色素P450酶可能是Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀代谢途径的一个关键酶,对洛伐他汀羟基化有重要作用,这为进一步对微生物转化洛伐他汀的研究打下了基础。

锌离子影响地中海拟无枝酸菌合成有机酸和利福霉素SV

在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加Zn2+(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响。72h^141h胞外丙酮酸、丙氨酸浓度分别比对照提高了19.7%~93.72%和降低了37.69%~59.55%;同时,胞外谷氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸的浓度分别比对照提高了7.62%~162.59%、1.99%~43.10%和25.84%~92.89%。胞外酪氨酸浓度(72h^120h)与对照差异不大,之后迅速提高,141h时酪氨酸浓度是对照组的2.56倍。利福霉素SV的效价在96h比对照提高了11.72%,120h时效价提高了9.1%;141h时效价仅比对照提高了3.5%。说明锌离子抑制了丙氨酸脱氢酶活性并引起丙酮酸积累,这使得丙酮酸流入三羧酸循环的碳通量增大,使由草酰乙酸衍生的赖氨酸和由α-酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大,促进了利福霉素SV的合成。但是,丙酮酸的积累也促进了芳环氨基酸的合成(如酪氨酸、苯丙氨酸),其会协同抑制利福霉素的芳环前体3-氨基-5-羟基-苯甲酸的合成,这可能是效价中后期增长放缓的原因。

中心组合设计优化东方拟无枝酸菌发酵生产万古霉素的微量金属离子

对万古霉素生产菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)V-0704摇瓶培养48 h时发酵培养基中添加的几种微量金属离子进行了优化。依次通过部分因子析因设计、最速上升实验、中心组合设计,并利用统计学软件Minitab对实验数据进行分析,得到一组较优的微量金属离子组合:Co2+浓度2.486×10-5g.mL-1、Mo6+浓度2.486×10-5g.mL-1,添加这些金属离子摇瓶培养72 h的万古霉素平均效价达到4946 U.mL-1,较未加金属离子提高了17%。

东方拟无枝酸菌DNA转化系统的建立

对东方拟无枝酸菌HCCB10007原生质体制备和再生条件进行了探索,结果表明以含2%甘氨酸的TSB培养基培养菌丝体,28℃经1mg/ml溶菌酶处理30min,形成的原生质体约达107个/ml,原生质体再生率为2.5%。将来源于HCCB10007的gtfE基因通过安普霉素抗性基因插入失活,构建质粒pLY26并经PEG介导转化HCCB10007原生质体,PCR鉴定结果表明转化成功。

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。

地中海拟无枝酸菌S699电转化方法的优化

地中海拟无枝酸菌S699(Amycolatopsis mediterranei S699)能够产生具有重要经济价值的抗生素———利福霉素B。在该菌株中建立高效的遗传操作系统是研究利福霉素生物合成机制以及构建基因工程高产菌株的基础。研究利用单因素试验探索了供体质粒的构型、甘氨酸溶度、MgCl2浓度及电转化参数对地中海拟无枝酸菌S699电转化效率的影响。结果表明,使用添加了0.05 g/L甘氨酸和2.5 mmol/L MgCl2的34%YEME培养基培养菌丝体,在9 kV/cm、25μF、550Ω的电转化条件下,以双链DNA为供体,转化效率最高可达到3.37×102个转化子/μg DNA。利用优化后的电转化方法,成功地获得了利福霉素生物合成基因簇中细胞色素P450氧化酶基因orf5的同源缺失突变菌株,证实了优化后的电转化方法可以很好地用于后期遗传学及利福霉素生物合成基因的研究。

东方拟无枝酸菌产万古霉素发酵工艺优化

采用东方拟无枝酸菌V19-07发酵产万古霉素,通过单因素实验对发酵工艺进行了优化,确定最优发酵工艺为:发酵温度28℃、发酵液pH值7.2、通气量1.0 vvm、溶解氧浓度10%。该工艺经50 L发酵罐验证,平均发酵效价达14117 U·mL^(-1),产量较优化前提高18.8%,可用于规模化生产。

拟无枝酸菌属羽毛降解菌株BJA-103的诱变育种

【目的】对具有羽毛降解能力的BJA-103菌株进行硫酸二乙酯(DES)诱变,筛选羽毛降解速率更快、降解程度更高的突变株,并对突变株产生的角蛋白酶性质进行初步探究,为其进一步扩大发酵及生产应用提供理论依据。【方法】使用DES对BJA-103菌株进行诱变,涂布解除氮代谢分解调节筛选培养基为第1次初筛,点植法接种牛奶平板为第2次初筛,羽毛摇瓶降解为复筛。得到理想突变株后,对该突变株进行羽毛降解试验,初步探究降解时间、温度、pH对角蛋白酶活性的影响。【结果】筛选获得解除氮代谢分解调节突变株库(1253株),牛奶平板筛选水解圈宽度为8.5~12 mm的突变株5株(RT、BM′、CV′、FX′、NK′),平均水解圈大小为野生型的2.5倍。羽毛降解复筛得到突变株NK′,降解试验中,其48 h内的羽毛降解率为65.29%,远大于野生型(12.82%);其最终降解率为90.74%(降解144 h),大于野生型的降解率79.24%。突变株NK′产生的角蛋白酶最适发酵时间为72 h,最适反应温度为70℃,最适反应pH为11。【结论】筛选出1株羽毛降解速率快、降解程度高的突变株NK′,其所生产的角蛋白酶可耐高温、高碱环境。