葡聚糖抗体的制备及其Elisa检测方法的建立

制备并筛选葡聚糖拟糖蛋白抗原,通过动物免疫获得葡聚糖多克隆抗体并建立葡聚糖的Elisa检测方法,应用于实际样品检测。以还原胺化法制备大分子葡聚糖-牛血清蛋白(BSA)拟糖蛋白质,通过SDS-PAGE与自由氨基测定,优化葡聚糖拟糖蛋白抗原制备反应,建立直接竞争Elisa筛选抗原活性。以制得的葡聚糖T40-BSA拟糖蛋白抗原为免疫原,经过免疫白兔后获得高效价多抗;建立检测葡聚糖多抗的间接非竞争Elisa方法。确定拟糖蛋白抗原的最佳制备条件(n(葡聚糖)/n(氧化剂NaIO4)=1/120,偶联时间24 h);筛选获得不同制备条件下与标准抗体结合最强的抗原产物T40-BSA,动物免疫获得多抗,优化实验条件:以质量浓度10μg/mL的T40-BSA为包被抗原,37℃时血清多抗和酶标多抗的反应时间均为45 min,质量分数5%小牛血清为封闭液后洗板;建立了基于T40-BSA拟糖蛋白抗原的不同相对分子质量葡聚糖间接竞争Elisa检测方法,并应用于对市售白糖中葡聚糖T40的含量检测。研究结果表明,葡聚糖-BSA拟糖蛋白抗原制备条件不同,对其免疫活性有影响。建立的检测方法有良好的线性,能用于实际样品中葡聚糖含量的检测。