拟胚体培养体系中造血表面标志的变化及其向红细胞分化潜能的研究

目的探讨拟胚体(EB)造血相关表面标志物的变化及其向红细胞定向诱导分化的潜能。方法利用悬浮培养体系使人胚胎干细胞(h ESCs)形成三维囊状结构(EB),通过添加细胞因子BMP-4、SCF和FL使EB向造血前体细胞分化,通过流式细胞术(FACs)检测细胞发育各个阶段内皮及血细胞表面分子的变化情况以判断细胞的不同发育阶段。采用胰酶消化处理的方式将EB消化为单个细胞并向红细胞诱导分化,在诱导的d7、d14、d21取样,流式检测分析红细胞的成熟程度。结果在EB培养体系中,d6即可检测到造血前体细胞表面标志物CD34和CD31,且在EB培养的d6-d21,CD34+CD31+细胞的比例逐渐升高,到d15达到顶峰(8.86%)。在红细胞定向分化过程中,红细胞的纯度达73.22%,免疫荧光染色显示:ε亚基的阳性率为88%(424/482),γ亚基的阳性率为94%(326/347),而β亚基的阳性率为0%(0/167)。结论建立了1种EB悬浮培养体系和体外诱导红细胞的方法;EB的造血相关表面标志物的表达呈现时序性变化,且由EB分化而来的红细胞具有早期胚胎红细胞的发育特点。

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究

目的:初步探讨在体外条件下诱导小鼠胚胎干细胞(EGFP-mESC)分化为精原干细胞(SSC)的条件,建立有效的技术平台。方法:采用部分模拟胚胎早期发育的方法,将EGFP-mESC(XY)经体外悬滴培养,制备拟胚体(EB);使用免疫磁珠分选法从EB中分离出表达原始生殖细胞(PGC)表面标志SSEA-1的细胞;获得的细胞经2μmol/L维甲酸(RA)诱导增殖,使之向雄性生殖细胞分化。对诱导的细胞采用RT-PCR及免疫荧光检测特异性基因及蛋白的碱性磷酸酶。结果:在诱导EGFP-mESC向雄性生殖细胞分化的过程中,采用RT-PCR方法检测到了雄性生殖细胞特异表达基因Sry、fragilis、stella、Tex14等mRNA的表达;利用激光共聚焦方法检测到SSC表面标志蛋白Stra8、integrin-α6及Hsp90α的表达。结论:采用RA体外诱导EGFP-mESC定向分化为SSC是可行的。

拟胚体直接诱导胚胎干细胞向树突状细胞的分化

直接从ES-D3胚胎干细胞(ESC)诱导分化出胚胎干细胞源性树突状细胞(esDC)。ESC单细胞悬液在低黏附性培养皿中悬浮培养形成拟胚体(EB)。取第14天的EB用含重组鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白细胞介素3(rmIL-3)的培养基在高黏附性组织培养瓶中培养10 d,消化细胞后传代培养。运用流式细胞仪检测细胞表面CD11c、MHCⅠ、MHCⅡ、CD86、CD80、CD83的表达情况。同时,运用脂多糖(LPS)刺激诱导细胞,观察其细胞形态学及MHCⅡ、CD80分子表达变化,并利用混合淋巴细胞培养观察其对同种淋巴细胞的刺激能力。结果显示在rmGM-CSF和rmIL-3细胞因子的作用下,EB在培养第4天开始出现大量早期的esDC,在接下来的培养中细胞大量扩增,常规消化后细胞保持很高的增殖活性并可传代培养。这些细胞表达高量的CD11c、低量的MHCⅠ,而不表达CD86、CD80、CD83及MHCⅡ。但当用LPS刺激作用后,该类细胞表现出成熟DC的细胞形态并上调MHCⅡ、CD80分子,并产生对同种淋巴细胞强烈的刺激作用(P<0.01)。因而,运用EB联合细胞因子rmGM-CSF和rmIL-3能从ESC中直接诱导分化出esDC。