拟赤梢鱼卵巢早期发育与sox3基因cDNA克隆及表达分析

为初步阐明拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)卵巢发育特征及sox3(sry related high mobility group box 3)基因在其卵巢发育过程中的作用,本研究通过组织切片观察了拟赤梢鱼卵巢早期发育过程,利用RACE技术克隆了该鱼sox3基因c DNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术分析了sox3基因在拟赤梢鱼不同组织及性腺不同发育时期的表达模式。结果显示,拟赤梢鱼卵巢在孵化后45 d分化形成,160 d时由Ⅰ期进入Ⅱ期,孵化后360 d,卵巢仍处于Ⅱ期。拟赤梢鱼sox3基因cDNA全长为1800 bp(GenBank登录号:MT952206),编码299个氨基酸,存在保守的HMG(histidine,methionine,glycine-rich)结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示,拟赤梢鱼SOX3蛋白与斑马鱼(Danio rerio)和翘嘴鲌(Culter alburnus)亲缘关系最近。此外,sox3基因在拟赤梢鱼卵巢中表达量最高,其次是脑和眼睛,在精巢和其他组织中微量表达;在性腺分化过程中,sox3基因在卵巢中表达量显著高于未分化性腺和精巢,在卵巢发育阶段表达量不断升高,而在精巢中持续低水平表达。综上,本研究推测sox3基因主要参与拟赤梢鱼卵巢的分化和发育。

拟赤梢鱼的胚胎发育和仔稚鱼生长特性观察拟赤梢鱼的胚胎发育和仔稚鱼生长特性观察

为阐明拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)胚胎发育和仔稚鱼发育特点,采用人工催产的方式获得受精卵,观察分析了拟赤梢鱼胚胎发育和仔稚发育的时序特征。结果表明:拟赤梢鱼成熟卵粒为黄色圆球形,平均卵径为(1.77±0.20) mm,遇水具微黏性;在水温23℃条件下,胚胎发育经历合子期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期和孵化出膜期7个阶段26个时期,共历时47h 55min完成孵化过程。初孵仔鱼在(23±1)℃水温条件下,经历卵黄囊期仔鱼(0—7d)、晚期仔鱼(8—26d)和稚鱼期(27—31d),进入幼鱼期;卵黄囊期仔鱼游泳能力差,随着卵黄囊逐渐消耗,体表色素斑、胸鳍和尾鳍等逐渐形成,消化道贯通,鳔充气;晚期仔鱼卵黄囊完全消失,仔鱼游泳能力增强,开口摄食,腹鳍形成,皮肤透明;稚鱼期鳞片形成并覆盖全身,鱼体形态已逐渐与成鱼无异。拟赤梢鱼仔稚鱼阶段全长生长特性公式为TL=0.0125x~2+0.3579x+6.2058 (R~2=0.9953),出膜15d内,仔鱼生长速度缓慢,全长日生长率仅为(0.38±0.02) mm/d, 15d后,仔鱼生长速度变快,全长日生长率可达(1.24±0.09) mm/d。研究初步阐明了拟赤梢鱼的胚胎发育和仔稚鱼发育的时序特征,为拟赤梢鱼的苗种规模化繁育提供了理论基础。

拟赤梢鱼消化系统的形态学与组织学结构特征

探明拟赤梢鱼消化系统的形态学和组织学结构,为其野生资源保护及人工养殖提供基础数据,采用常规解剖学和石蜡切片技术对拟赤梢鱼健康成体消化系统的形态学和组织学特征进行研究。结果表明:拟赤梢鱼的平均体重为(217.81±53.50)g,体长为(24.88±1.49)cm,体重(y)随体长(x)变化的回归方程为y=0.004x^3.417,R^2=0.745。拟赤梢鱼无胃的分化,消化系统由消化道和肝胰脏组成。其肠道细长,呈长管状,紧接于食道后,呈“S”形走向,肠道管径由前肠至后肠逐渐变细,前肠和中肠的长度差异不显著(P>0.05),后肠极显著长于前肠和中肠(P<0.01),肠长比为1.11±0.09,肠重比为0.006±0.003。肝脏和胰脏不分,合为肝胰脏,胰腺组织弥散分布于肝组织中,肝胰重比为0.010±0.003。消化道管壁由黏膜层、肌层和浆膜层3层组成,食道的黏膜层最薄,前肠的最厚;食道的肌层最厚,与肠道的肌层厚度差异显著(P<0.05),肠道各段的肌层厚度差异不显著(P>0.05)。前肠的浆膜层最厚,其次为后肠,食道的最薄;前肠的浆膜层显著厚于食道和中肠(P<0.05),与后肠差异不显著(P>0.05)。后肠富含杯状细胞,显著多于其他部位(P<0.05),其次为前肠,食道中几乎没有杯状细胞。拟赤梢鱼消化系统结构与功能(食性)密切相关。

拟赤梢鱼消化酶和免疫酶的分布与活性

为拟赤梢鱼基础生物学及消化生理特征的深入研究奠定理论基础,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法,分别研究拟赤梢鱼消化系统(食道、前肠、中肠、后肠和肝胰脏)中蛋白酶(PRO)、淀粉酶(AMS)、酯酶(EST)3种消化酶和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)2种免疫酶的分布及活性。结果表明:消化酶和免疫酶在拟赤梢鱼的消化系统中均有表达,并存在谱带缺失现象;PRO活性为食道>前肠>中肠>后肠>肝胰脏,AMS活性为后肠>中肠>前肠>食道>肝胰脏,EST活性为肝胰脏>前肠>中肠>食道>后肠,SOD活性为前肠>中肠>食道>肝胰脏>后肠,POD活性为肝胰脏>后肠>中肠>食道>前肠,各种酶在消化系统中分布及活性均表现出明显的组织特异性。

黑龙江拟赤梢鱼资源调查和生物学测定

统计了2020年秋季9-10月黑龙江全江段,以及2015年、2019年5-6月抚远乌苏里江通江口至抓吉镇江段拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)的资源、生长和繁殖等生物学调查数据。结果显示:秋季9-10月在黑龙江上游绥滨到漠河江段可捕获到不同大小的鱼体,较大个体达2100 g,从绥滨江段开始捕获有少量的个体,到开库康江段上游捕获数量逐渐增多;春季在黑龙江下游抚远乌苏里江通江口至抓吉镇江段,捕到的个体多数性腺已成熟,体重在477~1254.9 g,体长在34.5~46.5 cm,其中体重在707.6~1098.0 g的数量占到了群体总数的83.68%。对采集到的165尾样本进行生长特征分析,体长(L)与体重(W)的回归方程式为W=0.0061L3.2239(n=165,R2=0.9958),体长、体重的生长方程为Lt=62.456[1-e-0.154(t-0.26)],Wt=4110.2[1-e-0.154(t-0.26)]3.2239,体重生长速度拐点为7.86龄,对应体长、体重为L=43.08 cm,W=1241.53 g。对2019年5-6月份在抚远乌苏里江通江口采捕的49尾鱼进行了繁殖生物学测定,主要为5~8龄性成熟的个体,雌雄性比为♀∶♂=1∶0.88,雌性成熟系数在6.3%~14.3%,绝对繁殖力为15312~41760粒,平均为(26120±7433)粒,雌性6龄组的繁殖贡献率最大,占繁殖群体总繁殖力的52%。

乌苏里江拟赤梢鱼肌肉营养成分分析与品质评价

采用常规方法对采自乌苏里江的野生拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)肌肉的常规营养成分、氨基酸组成、脂肪酸组成进行测定。结果表明:拟赤梢鱼肌肉中水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量分别为77.98%、19.05%、1.66%和1.20%;其肌肉(鲜样)中含有18种氨基酸,总量为19%,其中8种必需氨基酸(EAA),总量为7.79%,2种半必需氨基酸(HEAA),总量为1.63%,8种非必需氨基酸(NEAA),总量为9.57%;其必需氨基酸的构成比例符合联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)优质蛋白质标准;肌肉中含有4种鲜味氨基酸(DAA),总量为6.99%;肌肉中EPA和DHA含量分别为4.20%和8.04%;根据氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS),拟赤梢鱼的限制性氨基酸为Val和Try,其必需氨基酸指数(EAAI)为90.05。综上,拟赤梢鱼是一种具有较高营养价值和食用价值的淡水鱼类,具有良好的开发利用前景。

Na^(+)、K^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)、葡萄糖和甘油浓度对拟赤梢鱼精子活力的影响

用促黄体生成激素释放激素类似物(LRH-A2)和马来酸地欧酮(DOM)催产体长(26.86±0.85)cm、体质量(194.03±18.27)g的5龄成熟雄性拟赤梢(Pseudaspius leptocephalus),采集精液。用去离子水和分析纯氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、葡萄糖和甘油分别配制不同浓度梯度的NaCl、KCl、CaCl_(2)、MgCl_(2)、葡萄糖及甘油激活液,采用生态显微观察法检测和研究不同浓度Na^(+)、K^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)及葡萄糖(Glu)和甘油(Gly)对拟赤梢鱼精子激活率、快速运动时间(FMP)、运动时间(MD)及寿命(LS)的影响。结果显示:在0.02~0.14 mol·L^(-1)浓度范围内,随着溶液中Na^(+)、K^(+)离子浓度的升高,精子激活率分别在0.08 mol·L^(-1)时显著降低至(80.95±2.17)%和(81.68±2.31)%;精子的FMP、MD和LS呈先增加后减少的趋势,在Na^(+)浓度为0.08 mol·L^(-1)时最高,分别为(26.87±0.69)s、(74.49±7.19)s和(446.48±21.96)s;在K^(+)浓度为0.10 mol·L^(-1)时最高,分别为(25.73±0.44)s、(55.53±4.38)s和(183.19±11.80)s。在Ca^(2+)和Mg^(2+)浓度为0.003~0.021 mol·L^(-1)范围内,拟赤梢鱼的精子激活率显著低于对照组的精子激活率(P<0.05);在Ca^(2+)浓度为0.003 mol·L^(-1)时,精子的FMP、MD和LS最高,分别为(15.97±0.56)s、(31.63±1.93)s和(48.12±1.74)s;而在0.006 mol·L^(-1)Mg^(2+)浓度下,精子的FMP、MD和LS达最高,分别为(17.63±0.68)s、(35.74±1.61)s和(66.31±5.19)s。在浓度为0.06~0.30 mol·L^(-1)范围内的Glu和Gly溶液中,精子激活率显著小于对照组水平(P<0.05),其精子运动能力随着Glu和Gly浓度的升高,呈先增加后降低的趋势,均在0.22 mol·L^(-1)时达到最高,此时Glu激活液中精子FMP、MD和LS分别为(25.51±1.84)s、(52.14±3.93)s和(76.74±4.05)s;而Gly激活液中精子FMP、MD和LS分别为(27.01±1.34)s、(48.16±7.41)s和(90.54±2.75)s。综上,0.02~0.12 mol·L^(-1)的Na^(+)、K^(+)溶液可显著提高精子活力,达到0.14 mol·L^(-1)时对精子活力具有抑制作用;0.003~0.021 mol·L^(-1)的Ca^(2+)和Mg^(2+)可显著抑制精子的激活,而0.22 mol·L^(-1)的葡萄糖和甘油可显著提高拟赤梢鱼精子的运动时间与寿命。

拟赤梢鱼的生物学特征和资源保护

拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)是黑龙江流域的特有鱼类物种。为了促进中国农业种质资源保护与利用研究的不断深入,根据近年来的鱼类资源调查结果和相关文献资料,总结了拟赤梢鱼的生物学和资源学特点,探讨了拟赤梢鱼资源保护和种质资源持续健康发展的途径。研究结果表明,拟赤梢鱼具有资源量少、生长缓慢、性成熟较晚、繁殖期短和绝对怀卵量低等生物学特点,其资源一旦遭到破坏,种群数量的恢复极为缓慢;拟赤梢鱼的栖息环境为偏冷的河流和湖泊,主要分布于黑龙江、松花江、嫩江、乌苏里江、牡丹江、呼玛河、额尔古纳河等江河的干流和支流中,以及其流域内的呼伦湖、镜泊湖、兴凯湖和五大连池等湖泊中;2000年以来,在河流中,还有拟赤梢鱼的记录,在湖泊中已经极少见到拟赤梢鱼;在黑龙江中游、上游和额尔古纳河中,还有一定数量的拟赤梢鱼,在其它河流中只是偶尔能见到拟赤梢鱼,该物种已处于濒危的状态。建议将拟赤梢鱼作为中国濒危珍稀动物加以保护,并加强其栖息地的保护和生态修复。

动物石蜡切片5种染色方法的比较

为了摸索出最佳的动物石蜡切片染色方法,试验以拟赤梢鱼消化道为材料,采用5种染色方法对其石蜡切片进行染色,并分别在4×10,10×10,40×10倍镜下对其染色效果进行观察、比较分析。结果表明:方法 2的染色结果为低倍镜下观察,核质颜色区分明显,核为蓝紫色,细胞质为红色,细胞层次边缘清晰;高倍镜下观察,核质颜色区分明显,细胞分层、细胞形态结构清晰,易于区分。说明方法 2的染色效果最佳。