利用细胞-指数式富集的配体系统进化技术筛选肿瘤细胞DNA适配子

目的建立一种通用的细胞-指数式富集的配体系统进化(Cell-SELEX)技术平台,用于筛选特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子。方法采用PCR法建立随机双链DNA(dsDNA)寡核苷酸文库,用卵白素包被的琼脂糖珠从dsDNA库分离单链DNA(ssDNA)文库;以体外培养的肿瘤细胞作为正筛选的靶标,以相同组织来源的正常对照细胞作为负筛选的靶标,消减法进行Cell-SELEX筛选和PCR扩增以获取DNA适配子;流式细胞仪监测适配子的富集效率(亲和力);采用常规分子生物学技术进行适配子的克隆、测序和序列分析。结果成功建立了ssDNA库,经过12轮Cell-SELEX筛选,获得了特异性结合于肿瘤细胞的DNA适配子;挑选120个阳性克隆送测序,鉴定出21个适配子,采用NCBI网站提供的Blastn程序进行精确比对未发现相似序列。结论本实验建立的技术平台可在较短时间内获取特异性结合于特定肿瘤细胞的DNA适配子。

指数式富集法配体进化组合化学技术的新进展

指数式富集法配体进化技术是一种从随机寡核苷酸文库中筛选靶分子的特异性配基的组合化学技术。利用该技术筛选到的寡核苷酸配基具有很高的亲和力和特异性，在基础研究、临床诊断以及治疗性药物的研制方面，均具有广泛的应用前景。

指数富集的配体系统进化技术研究进展及在食品检测中的应用

核酸适配体是指能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的寡核苷酸序列,可识别的靶分子范围非常广,并均可通过指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选得到。近年来,在传统SELEX技术的基础上,新的SELEX技术不断出现。这些新技术的出现,在不断完善SELEX技术的同时,也极大地推动了适配体技术在各学科领域中的发展及应用。本文对核酸适配体的筛选方法进行了总结,并介绍了其在食品检测领域的应用现状和发展方向,为核酸适配体的筛选与应用提供了参考。

核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性(抗核酸酶降解能力)的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术(捕获-SELEX,Capture-SELEX)和均相筛选技术(氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX)。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件(文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度)和所获得的适配体的亲和力(KD,解离常数,dissociation constant)和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的KD和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。

利用SELEX技术筛选针对寄生虫的核酸适配体研究进展

核酸适配体是人工合成的寡核苷酸序列,经指数富集的配体系统进化技术(SELEX)体外筛选获得。近年来,核酸适配体在生物医学领域的研究备受关注,因其能够与寄生虫、细菌、病毒等不同病原体的特定靶标进行高亲和力的特异性结合。该文综述了利用指数富集配体系统进化技术筛选针对寄生虫抗原的核酸适配体研究进展,介绍了指数富集配体系统进化技术的基本原理和流程,并重点探讨了在寄生虫研究领域中应用该技术筛选核酸适配体的最新研究进展。

核酸适配体技术在食品重金属检测中的应用研究进展

近年来食品中重金属超标对人们健康构成了威胁,所以对食品中重金属检测技术的开发成为了重要研究内容。虽然传统的检测技术对重金属进行了高选择性和高灵敏度的检测,但是仍需要一种简单、快速、有效、成本低廉的方法用于食品安全领域的快速检测。核酸适配体为一段单链DNA或者RNA序列,是经体外筛选技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适配体具有靶分子广、灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点,因而被广泛用于食品安全检测领域。本文综述近年来核酸适配体技术对食品中Hg2+、As3+、Pb2+的检测,并对核酸适体技术在食品重金属检测领域的应用前景进行了展望。

黄曲霉毒素B1核酸适配体筛选和检测方法的建立

建立一种高灵敏的快速检测黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)的方法。基于氧化石墨烯(graphene oxide,GO)通过π-π共轭吸附单链寡核苷酸(single-strand DNA,ssDNA),对已结合靶标的ssDNA吸附能力较弱的特性,设计针对AFB1核酸适配体的筛选方案。经过10轮筛选,共获得45条ssDNA序列。挑选具有代表性的6条序列进行亲和力分析实验,其解离常数Kd分别为16.29、27.88、18.54、23.11、47.94、22.31 nmol/L。选用亲和力较高的AFB-5、AFB-8进行特异性实验,结果显示所筛选的适配体能特异性吸附AFB1。最后利用适配体AFB-8作为识别元件建立了基于纳米金比色检测AFB1的方法。在优化的检测条件下,AFB1质量浓度与A520 nm值有良好的线性关系,其回归方程为y=-0.00709x+0.46142(R^2=0.9979),线性范围为0.025~10 ng/mL,检出限为0.025 ng/mL。通过特异性实验和对大米样品加标回收实验,加标回收率为83.36%~105.74%,证明本方法的可行性。

Cell-SELEX技术筛选急性早幼粒细胞白血病NB4细胞适配体

目的用以细胞为靶标的指数富集配体的系统进化(Cell-SELEX)技术获得与急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4高亲和力、高特异性的适配体。方法以NB4细胞为靶标,用Cell-SELEX技术从随机单链DNA(ssDNA)文库中筛选出一组适配体,将筛选得到的适配体群进行克隆、测序及结合力测定,用流式细胞仪和荧光显微镜对结合率最高的适配体进行亲和力和特异性分析。结果第1,4,7,10,13,16,19轮筛选获得的次级文库与NB4细胞的结合率分别为(1.6%,3.8%,6.3%,11.4%,15.4%,19.9%,16.7%);第16轮筛选的21个阳性克隆菌测序结果表明,存在有3种高度富集的适配体,分别为CX1序列2个,CX5序列3个,CX9序列16个;流式细胞仪检测3种序列的结合率分别为9.7%,12.6%,17.2%;CX9的解离常数(Kd)为16.2 nmol/L;荧光显微镜下发现,CX9与NB4细胞结合的荧光强度高于K562细胞。结论用Cell-SELEX技术成功筛选到针对NB4细胞的适配体CX9,为荧光标记适配体快速鉴定APL提供实验依据。

核酸适配体—靶标复合物解离常数测定方法研究进展

核酸适配体是通过体外指数富集配基系统进化技术筛选到的一小段单链DNA或RNA寡核苷酸片段,能够与靶标高亲和力、高选择性地结合。为了在实际检测中应用核酸适配体,必须深入了解核酸适配体—靶标的结合过程,如测定复合物的解离常数。本文综述了近年来有关核酸适配体—靶标复合物解离常数测定的方法。这些方法大致上分为两大类:一类是基于分离策略的测定方法,如透析法、超滤法、凝胶电泳法、毛细管电泳法和高效液相色谱法;另一类是基于均相策略的测定方法,如荧光强度法、荧光各向异性法、紫外可见分光光度法、圆二色谱法以及表面等离子体共振法等。本文对每种方法的原理、应用范围和特性进行了概括和比较,并对未来的发展趋势进行了展望。

适配体技术及其在医学检验研究中的作用

适配体是利用指数富集配体的系统进化技术从含有大量序列的随机文库中筛选出来,能通过特定三维结构与靶标紧密结合的单链DNA或RNA。适配体不仅能与各种有机物或无机物靶标分子高特异性、高亲和力结合,还具有分子量小,免疫原性低,稳定性好,制备和标记方便等优点。适配体将有可能替代抗体,在疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用。本文就适配体作用和筛选的原理及策略、适配体技术在医学检验研究中的作用以及面临的挑战作简要的述评。

指数级富集配体的系统进化技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子

目的采用指数级富集配体的系统进化(SELEX)技术筛选高转移肝癌细胞HCCLM3的ssDNA适配子。方法构建长度为71 nt的随机文库,中间为25 bp的随机序列,通过12轮反复的SELEX筛选获得特异性结合HCCLM3细胞的ssDNA适配子,并初步测定筛选的适配子与细胞的亲和力,对结合力高的适配子进行克隆测序,用RNA structure 5.3分析适配子序列的二级结构。结果经过12轮正向筛选及6轮低转移肝癌细胞MHCC97-L的反筛后,获得了与HCCLM3细胞具有高亲和力的ssDNA适配子;将第12轮ssDNA经克隆测序获得10条测序结果,其中有4条序列一致,另外有2条序列也一致;二级结构预测可知ssDNA适配子二级结构主要以"发夹型"构型为主。结论成功筛选获得了高亲和力的转移肝癌细胞HCCLM3 ssDNA适配子,为实现适配子靶向性治疗奠定了一定的理论基础。

应用双向热循环消减SELEX技术筛选胃癌血清核酸适配体

胃癌是发病率及死亡率均较高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。血清肿瘤标志物的检测对提高早期胃癌的检出率,改善胃癌的治疗有重要的意义。核酸适配体以其灵敏度高、靶向性强等优势显示出了较强的临床适用性。本研究以双向热循环消减指数富集式配基系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术为支持,纳米(琼脂)磁珠材料为载体,胃癌血清及正常人血清为筛选靶标,结合高通量测序技术建立了快速高效的核酸适配体筛选方法。经过19轮双向筛选,获得高重复率的胃癌血清特异性核酸适配体序列10条及正常人血清特异性核酸适配体序列8条。将这些序列分别混合并制成检测试剂A、B,结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术,对100份临床血清样本进行特异性验证。通过比较分析,建立了快速高效的胃癌血清检测技术。结果显示,核酸适配体G-AP1与N-AP1的二级结构类似于抗体的“Y”型,且呈茎环状。检测试剂A、B对胃癌及正常人血清的检出率分别为92%和88%。表明本技术可以较准确地筛选得到高特异性和强亲和力的核酸适配体,体现了核酸适配体作为新型肿瘤标志物在临床检测及治疗的应用潜力。

核酸适配体技术在胰腺癌诊断和治疗中的应用

胰腺癌因其早期无特异性体征和症状,难以实现早期诊断,且由于缺乏有效的治疗手段,是目前死亡率最高的癌症之一,因此实现胰腺癌的早期诊断和有效治疗具有重大意义。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术筛选得到的具有高亲和性、高特异性,可识别靶标分子的寡核苷酸片段,具有类似抗体的特点。核酸适配体因其良好的特性,近年来成为研究的热点。目前已有多个可识别胰腺癌的核酸适配体被报道,有望实现癌症的早期诊断。核酸适配体偶联药物也是目前热门的研究方向,可提高胰腺癌治疗药物的靶向治疗能力。本文简要介绍核酸适配体技术的进展,并就其在胰腺癌早期诊断和治疗中的应用做一介绍。

基于氧化石墨烯-SELEX技术对氟苯尼考核酸适配体的筛选及其结构分析

氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L~54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。

基于细胞的指数富集配体系统进化技术的肺癌细胞核酸适配体的筛选及其在肿瘤诊治中的应用

核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的寡核苷酸序列。已有研究表明,核酸适配体在肿瘤诊断及治疗方面具有良好的应用前景。因此,本文主要针对肺癌细胞核酸适配体的筛选、表征等方面展开论述,初步探讨核酸适配体作为靶向载体和靶向药物在肿瘤诊断治疗中的作用,为肿瘤的早期诊断及早期治疗提供新思路。

利用SELEX技术筛选小檗碱核酸适配体及其亲和力表征

小檗碱是一种价格低廉且生物安全性良好的小分子化合物,筛选能与小檗碱互相作用的核酸片段,旨在开发新型遗传元件并拓展其在生物技术领域的应用。利用指数富集的配基系统进化技术(SELEX),经8轮实验从随机单链DNA文库中筛选出4条能与小檗碱高度特异性结合的核酸适配体。对其中两条重现性较好的适配体进行结构模拟分析表明,适配体序列富含鸟嘌呤和胞嘧啶且多形成茎环及G-四链体结构。亲和力测定结果显示,其中的2条核酸适配体与小檗碱作用的解离常数Kd都处于nmol级,表现出较高的亲和力,适配体S1的Kd值最小,仅为523 nmol/L,与小檗碱亲和力最大。

全细菌SELEX法筛选粪肠球菌特异性适配体

肠球菌(Enterococcus)是内源性和外源性医院感染的第二大病原菌,检出率仅次于大肠杆菌,从分子水平上发展靶标的高亲和力分子探针对肠球菌的识别和检测具有非常重要的意义。本研究以粪肠球菌为靶标,运用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment, whole-bacteria SELEX),从全长为79个核苷酸包含35个随机碱基序列的单链DNA文库中筛选与靶标高亲和力、高特异性结合的适配体,利用荧光分析法监控筛选过程中不同轮次所得次级文库与粪肠球菌的结合力,经12轮筛选和克隆测序,获得了39条适配体序列。进一步对筛选得到的适配体进行序列比对、二级结构分析、流式细胞分析、解离常数(Kd)测定及特异性验证,最终获得一条与粪肠球菌能特异性结合的适配体Apt 21,其K_d值为549.2±147.4 nmol/L。该适配体可作为粪肠球菌检测的识别元件,为建立基于适配体的新型粪肠球菌检测方法奠定了基础。

基于核酸适配体的肉制品中污染物检测技术研究进展

核酸适配体是经体外筛选技术得到的能够特异性结合靶物质的由十几个或几十个核苷酸组成的寡聚核苷酸片段。适配体分子质量较小、易于体外合成和修饰、化学稳定性好,且不依赖于生物体或细胞环境,具有空间结构多样和靶标分子广泛的特点,对包括金属离子、有机小分子、生物分子,甚至细胞和微生物在内的各类靶物质具有特异性识别作用,被誉为"化学抗体"。本文综述了核酸适配体的特点及其筛选方法,列举了核酸适配体在肉制品非法添加物、金属离子、病原微生物以及生物毒素检测中的应用,并对其应用前景进行了展望。

小分子靶标核酸适配体研究进展

核酸适配体是能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸。目前,在生物传感、疾病诊断和治疗等方面,以核酸适配体作为分子识别元件已经开发了许多具有应用可行性的各种检测方法。尽管核酸适配体具有这些方面的应用可能性,但是目前能够结合小分子的核酸适配体非常少。小分子具有多种多样的生物功能以及临床、商业价值,因此针对小分子靶标展开研究,开发新型、实用的分子识别探针用于检测这些小分子具有重要的研究意义。作者主要介绍了针对小分子靶标核酸适配体开发所面临的技术挑战,以及在生物传感和食品安全应用方面所存在的机遇。

细菌的核酸适配体筛选的研究进展

核酸适配体（aptamer）是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选的能够以高亲和力和高特异性识别靶标分子或细胞的核糖核酸（RNA）和单链脱氧核糖核酸（ssDNA）。作为化学抗体,核酸适配体的制备和合成比抗体的成本更低。核酸适配体的靶标范围极其广泛,包括小分子、生物大分子、细菌和细胞等。针对细菌靶标筛选的适配体,目前主要应用于食品、医药和环境中的细菌检测。细菌的核酸适配体筛选可以通过离心法将菌体-适配体复合物与游离的适配体分离,并通过荧光成像、荧光光谱分析、流式细胞仪分选、DNA捕获元件、酶联适配体分析等方法表征适配体与靶标的相互作用。筛选出的适配体可结合生物、化学检测方法用于细菌检测。本文介绍了细菌适配体的筛选和表征方法以及基于适配体的检测方法的最新进展,分析了不同检测方法的利弊,并列出了2011~2015年筛选的细菌的核酸适配体。