香茅醛对指状青霉孢子麦角固醇合成的影响

探讨了香茅醛对指状青霉抑霉唑敏感(Pds01)和抗性(Pdw03)菌株孢子萌发过程中麦角固醇合成的影响。结果表明:不同含量香茅醛能显著抑制Pds01和Pdw03孢子萌发,半抑制浓度分别为0.8μL/mL和3.2μL/mL。经半抑制浓度香茅醛处理不同时间后,Pds01和Pdw03孢子麦角固醇含量显著降低,羊毛固醇含量显著升高;麦角固醇合成关键基因表达受到显著影响,Pds01的ERG9基因上调表达峰值早于Pdw03,两者ERG3基因的表达量皆显著下调。本研究表明香茅醛通过抑制ERG3的表达降低Pds01和Pdw03孢子麦角固醇合成,进而影响孢子萌发,可为柑橘采后病害绿色防腐保鲜剂的开发提供理论依据。

不同发育期椪柑精油对意大利青霉和指状青霉的抑制作用

对不同发育期(7、8、9和10月)的椪柑(CitrusreticulataBlanco)果皮精油进行GC-MS分析,共鉴定出柠檬烯(47.28%～58.40%)、γ-松油烯(8.27%～13.23%)、β-芳樟醇(3.48%～7.86%)、β-月桂烯(6.24%～7.50%)、α-蒎烯(5.07%～6.05%)、β-蒎烯(2.30%～3.45%)和辛醛(2.04%～2.48%)等50种萜烯类化合物。椪柑果皮精油及其所含的6种潜在抑菌组分(柠檬醛、辛醛、壬醛、癸醛、β-芳樟醇和α-松油醇)的体外抑菌实验结果表明:不同发育期椪柑果皮精油对意大利青霉(Penicillium italicum)的抑制作用要强于指状青霉(P.digitatum);潜在抑菌组分中柠檬醛和辛醛对意大利青霉的抑菌效果最好,壬醛和辛醛对指状青霉的抑菌效果最好。柠檬醛和辛醛对意大利青霉的最小抑菌浓度(MIC)、壬醛和辛醛对指状青霉的MIC均为0.50μL/mL;β-芳樟醇和α-松油醇对意大利青霉和指状青霉的MIC均为2.00μL/mL。

椪柑精油对指状青霉的抑制作用

采用水蒸气蒸馏法提取椪柑(Citrus reticulate Blanco)果皮精油,并用GC-MS对其成分进行分析,共鉴定出39种成分,主要包括柠檬烯(12.18%)、β-芳樟醇(10.88%)、γ-松油烯(9.37%)、5-亚乙基-1-甲基-环庚烯(9.37%)、β-月桂烯(9.36%)、β-蒎烯(8.12%)、2-蒈烯(7.8%)、α-蒎烯(6.74%)、辛醛(5.14%)、α-侧柏烯(3.99%)和β-水芹烯(3.31%)等。并测定不同体积分数椪柑精油对指状青霉孢子萌发和菌丝体生长的影响。结果表明:当体积分数不高于0.25%时,椪柑精油对孢子萌发和菌丝体生长均有促进作用;精油体积分数高于5%时,对孢子萌发和菌丝体生长表现出抑制作用。本实验表明椪柑精油对指状青霉生长具有明显抑制作用。

砂糖橘精油化学组成及对指状青霉的抑菌活性

采用水蒸气蒸馏法提取砂糖橘(Citrus reticulate Blanco)果皮精油,并用GC-MS对其成分进行分析,共鉴定出17种成分,主要包括柠檬烯(77.99%)、β-月桂烯(3.74%)、β-水芹烯(2.78%)、罗勒烯(2.64%)、β-芳樟醇(2.35%)、α-蒎烯(1.60%)、正辛醇(1.54%)、癸醛(1.24%)、4-松油醇(1.10%)和4-十一烯(1.04%)等。测定不同添加量(0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00μL/mL)砂糖橘精油对指状青霉孢子萌发和菌丝体生长的作用。结果表明:低添加量(<2.5μL/mL)砂糖橘精油对指状青霉孢子萌发无影响甚至有促进作用,对指状青霉菌丝体生长有轻微的抑制;而高添加量(10μL/mL)则显著抑制孢子萌发和菌丝体生长(P<0.05)。本实验表明砂糖橘精油在防治指状青霉具有一定作用。

指状青霉提取物对大肠杆菌infA基因的致突变研究

为了研究分离获得的引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉提取物的致突变作用。方法：将Ｅ．ｃｏｌｉ ｋ１２菌株作为诱变对象，利用ＰＣＲ扩增得到ｉｎｆＡ基因片段，通过Ｔ载体克隆并作序列分析。结果：ｉｎｆＡ基因片段中 有５个点突变存在；推导氨基酸序列有一个氨基酸变异（Ｌｙｓ→Ｖａｌ）。结论：指状青霉提取物可引起 Ｅ．ｃｏｌｉ ｋ１２菌株 基因突变。

指状青霉cyt b_5和cyt b_5r基因克隆及与cyp51A的共表达

为探究指状青霉细胞色素b5(Cyt b5)与细胞色素b5还原酶(Cyt b5r)在细胞色素P450 CYP51A电子传递方面的功用,研究了指状青霉CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达机制;并检测了其对于cyp51A基因表达水平的影响。通过转录组分析筛选并PCR克隆获得了cyt b5与cyt b5r基因,分别命名为HS-Pdcyt b5和HS-Pdcyt b5r。以多基因串联克隆载体p PICZαA为骨架构建了指状青霉共表达质粒ppbr A(p PIC-Pdcyp51A-cyt b5-cyt b5r);电转化法将重组质粒ppbr A导入毕赤酵母X-33中。q RT-PCR分析结果显示,CYP51A与Cyt b5-Cyt b5r共表达后,其基因表达水平升高54%-97%,并维持较长时间(48-72 h)。表明Cyt b5-Cyt b5r系统可将电子高效转移给CYP51A,从而增强cyp51A基因的转录表达。从指状青霉中克隆表达HS-Pd Cyt b5和HS-Pd Cyt b5r蛋白,并通过共表达的方式研究cyp51A基因的功能尚为首次报道。

指状青霉提取物诱发E.coli ND-160及K12 infA基因突变

背景与目的:研究指状青霉(Penicillium digitatum)提取物对大肠杆菌菌株的致突变性。材料与方法:采用E.coli ND-160菌株回复突变试验、K12infA基因突变试验及其突变序列分析。结果:指状青霉提取物:①可明显地诱导ND-160菌株回复突变;②对K12茼株可诱发其infA基因DNA序列中5个碱基位点突变,且其中1个位点的突变还可导致编码相应氨基酸的改变(Lys→val)。结论:指状青霉对大肠杆菌基因有明显的致突变性。

指状青霉诱发大鼠细胞DNA突变效应研究

目的 :研究指状青霉 (Penicilliumdigitatum)的致突变效应。方法 :采用E .coliND 16 0菌株 ,大鼠肺及肝原代细胞非程序DNA合成 (UDS)试验和E .coliK12infA基因突变试验及infA基因序列测定和分析。结果 :指状青霉提取物 :①可明显地诱发E .coliND 16 0菌株回复突变 ;②可明显诱导大鼠肝原代细胞UDS((P <0 .0 5 ) ,极显著诱导肺原代细胞UDS(P <0 .0 1) ;③可诱导E .coliK12infA基因DNA序列中 5个碱基位点突变 ,且其中 1个位点的突变还可导致编码相应氨基酸的变异。结论

指状青霉致突变性研究

目的：研究指状青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）提取物的致突变性。方法：采用了细菌回复突变试验，小鼠骨髓 ＰＣＥ微核试验，大鼠肺及肝原代细胞程序外ＤＮＡ合成试验（ＵＤＳ）和大肠杆菌 Ｋ１２ ｉｎｆａ基因突变试验及 ｉｎｆＡ基因 序列测定和分析。结果：指状青霉提取物：①可明显地诱发大肠杆菌ＮＤ－１６０菌株回复突变；②可使小鼠骨髓 ＰＣＥ微核率极显著增高（Ｐ＜０．０１）；③可显著诱导大鼠肝原代细胞ＵＤＳ（Ｐ＜０．０５）及极显著诱导肺原代细胞ＵＤＳ （Ｐ＜０．０１）；④可诱发大肠杆菌Ｋ１２ ｉｎｆＡ基因ＤＮＡ序列中５个碱基位点突变，且其中１个位点的突变还可导致翻 译相应氨基酸的变异。结论：指状青霉对原核细胞和真核细胞，无论在体内或体外均有致突变活性。

指状青霉提取物诱发大鼠肺及肝原代细胞DNA损伤作用

目的探讨指状青霉（Penicilliumdigitatum）提取物对大鼠肺及肝原代细胞的DNA损伤作用。方法用指状青霉提取物诱发大鼠肺及肝原代细胞的程序外DNA合成（UDS）。结果指状青霉提取物均可诱发大鼠肺及肝原代细胞的UDS，尤其是对肺原代细胞的作用更为明显（P＜0.01）。结论指状青霉提取物对大鼠肺及肝原代细胞DNA有损伤作用，从而证实其对哺乳动物细胞具有明显的遗传毒性。

毛霉诱导脐橙产抗病物质对指状青霉和酸腐菌的抑制

绿霉和酸腐是柑橘果实采后主要的病害,生产上迫切需要化学杀菌剂的替代方法。该研究对毛霉诱导脐橙果皮产生的具有抗病活性的红色物质(Citru Peel Red-substance Extract,CPRE)进行部分分离纯化,评价了CPRE对指状青霉和酸腐菌的抑菌活性,分析活性成分对两病原真菌菌丝细胞壁与膜功能的影响。结果表明,在50~200μg/mL的质量浓度下,CPRE对指状青霉和酸腐菌的孢子萌发,芽管伸长,菌丝生长有强烈的抑制作用,并且呈现剂量效应,最低抑菌浓度均为200μg/mL。进一步研究表明,与空白对照比较,50、100μg/mL抗菌活性成分处理明显改变指状青霉和酸腐菌菌丝细胞壁中几丁质分布,降低了细胞壁中几丁质含量、促进了质外体碱性磷酸酶的释放,表明CPRE严重损伤两致病真菌菌丝的细胞壁功能;CPRE处理还明显损伤两病菌菌丝的细胞膜通透性(P<0.05),刺激菌丝膜外电导率显著上升(P<0.05),加剧细胞内蛋白和核酸的丢失,降低了菌丝细胞膜总脂质含量,影响了细胞膜的正常功能。上述结果表明,红色抗菌成分在防控柑橘采后绿霉病和酸腐病中有潜在应用前景。

冷藏过程中温州蜜柑角质层组分变化及其对指状青霉生长的影响

角质层在果实采后贮藏中具有多重重要的生理功能。本实验以温州蜜柑(Citrus unshiu)为材料,对其冷藏过程中角质层的变化特征及其对指状青霉(Penicillium digitatum)孢子萌发和菌丝生长的影响进行了分析。结果表明:温州蜜柑冷藏过程中蜡质、角质含量整体上呈先上升后下降的趋势,其中角质含量的变化幅度最大;脂肪酸是外蜡中含量最丰富的蜡质组分,在冷藏前10 d,脂肪酸含量从0.73μg/cm^2增加到3.09μg/cm^2,之后下降至0.64μg/cm^2(40 d);萜类物质主要存在于内蜡中,内蜡中萜类物质含量在冷藏过程中呈下降-上升的反复波动状态;角质单体成分主要为肉桂酸和十六碳二酸,冷藏时,肉桂酸含量逐渐下降,在第40天时最低,为13.90μg/cm^2,十六碳二酸含量先增加到17.90μg/cm^2(10 d),然后下降到6.60μg/cm^2(40 d);体外实验表明,角质能显著抑制指状青霉孢子萌发,而内蜡能显著抑制菌丝生长(P<0.05)。这些结果揭示了贮藏过程中角质层变化的生化基础及角质层各组分对指状青霉的影响,为提高温州蜜柑柑橘品种的耐贮性提供了参考。

柠檬醛对指状青霉菌丝体膜脂过氧化的影响

探讨柠檬醛对指状青霉菌丝体膜脂过氧化的影响。研究发现,经最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC,2.0μL/m L)和最小杀菌浓度(minimal fungicidal concentration,MFC,4.0μL/m L)柠檬醛处理后,指状青霉菌丝体发生扭曲变形且表面出现明显褶皱,表明细胞完整性遭到破坏。不同质量浓度柠檬醛处理指状青霉后,其胞外电导率及K+泄漏量均显著增加,而总脂质含量降低,说明柠檬醛处理能增加指状青霉细胞膜通透性,导致细胞膜结构遭受破坏。进一步研究发现,MIC、MFC柠檬醛处理促使指状青霉总丙二醛含量、过氧化氢含量和脂氧合酶、过氧化物酶活性升高。本研究结果表明:柠檬醛处理可诱导指状青霉菌丝体发生严重的膜脂过氧化损伤,损伤细胞膜结构,从而抑制指状青霉菌丝体生长。

VmaH和PMA在指状青霉中的表达及其作为潜在杀菌作用靶点的可能性

目的:研发安全、高效、具有新型作用靶点的杀菌剂,在对指状青霉(Penicillium digitatum)VmaH和PMA进行生物信息学和表达模式分析的基础上,进一步探讨两个基因作为潜在杀菌作用靶点的可能性。方法:以指状青霉为实验材料,使用Pfam、MEGA 5.0等在线软件对VmaH和PMA的编码蛋白进行生物信息学分析,进一步利用实时聚合酶链式反应技术分析VmaH和PMA在指状青霉中的表达规律。结果:结构域预测发现,VmaH具有2个非常保守的结构域,分别为N端结构域和C端结构域;PMA具有3个非常保守的结构域,分别为N端结构域、E1-E2 ATPase结构域和水解酶结构域。同源比对结果发现真菌物种中VmaH和PMA的氨基酸相似度分别为79%、80%,表明不同真菌间VmaH和PMA高度保守。进化树分析显示指状青霉VmaH和PMA与青霉属和曲霉属的VmaH和PMA具有较近的亲缘关系。相较于PMA,VmaH在指状青霉的整个生长过程中一直保持较高的表达水平,而PMA的基因表达水平在指状青霉生长后期显著下调。葡萄糖饥饿显著降低了VmaH和PMA的基因表达水平,葡萄糖回补可以恢复两个基因的表达水平,尤其是VmaH的表达量会显著上调。极酸极碱条件下VmaH和PMA的表达量均显著下调,弱酸和弱碱性环境使PMA基因的表达量增加。氧化、还原剂处理均能显著降低VmaH和PMA的表达水平,且PMA的下调尤为显著。PMA在不同杀菌剂处理条件下表达量均显著下降;而VmaH对不同杀菌剂处理的响应有所差异。结论:通过VmaH和PMA的生物信息学和表达规律分析,可以将VmaH和PMA所编码的蛋白作为指状青霉潜在杀菌作用靶点进行深入研究。

乳酸菌产苯乳酸对指状青霉的抑菌活性及作用机理

为探究乳酸菌Lactobacillus plantarum CKXP13和L.plantarum CWXP24产苯乳酸的能力以及苯乳酸对柑橘绿霉病的控制效果及其抑菌机理,本实验使用高效液相色谱法测定这两株乳酸菌的苯乳酸产量,并通过研究苯乳酸处理后指状青霉的孢子存活率、菌落直径、菌丝形态、胞外电导率来探究其抑菌机理,最后以柑橘果实绿霉病干预实验探究苯乳酸对绿霉病的控制效果。结果表明,L.plantarum CKXP13、L.plantarum CWXP24均能产生苯乳酸,产量分别为42.4 mg/L和91.9 mg/L,苯乳酸质量浓度为2.5、5.0、10.0 mg/mL条件下,指状青霉的孢子存活率、菌落直径随苯乳酸质量浓度上升而显著降低(P<0.05),菌丝也随苯乳酸质量浓度升高出现表面粗糙、相互缠绕、形成塌陷或树瘤状凸起的情况,同时乳酸菌还能增强病原菌细胞膜的通透性,促进细胞内容物泄漏,导致病原菌死亡。果实绿霉病干预实验证明,10、20 mg/mL苯乳酸都能有效控制柑橘果实绿霉病。综上所述,苯乳酸作为天然杀菌剂在控制柑橘采后绿霉病方面具有良好的应用潜力和开发前景。

γ-辐照对指状青霉的抑制作用及在椪柑果实保鲜中的应用

本实验探究强度为0.25、0.50、0.75及1.00kGy的γ-射线对供试菌指状青霉的生长、培养液相对电导率、菌丝体总糖与可溶性蛋白含量、苹果酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性大小的影响;同时考察了不同强度的γ-辐照对椪柑果实失重率、呼吸强度、可溶性固形物、有机酸及抗坏血酸含量的影响。结果表明:γ-辐照可以有效的抑制指状青霉的生长,抑制率和辐照强度呈正相关;同时,γ-辐照能增加菌丝体细胞膜渗透性,降低菌丝体总糖与可溶性蛋白的含量以及与能量代谢的相关酶活性,从而打乱指状青霉正常的生理代谢。此外,不同强度的γ-辐照对椪柑果实的采后生理代谢也有不同程度的影响,在所有的辐照强度中,0.5kGy的γ-辐照降低椪柑失重率、呼吸强度,同时抑制可溶性固形物、有机酸及抗坏血酸含量降低的综合效果最佳。

α-松油醇对指状青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03的抑制作用

本研究探讨了α-松油醇对指状青霉抑霉唑抗性菌株Pdw03的抑制作用及其抑菌机理。体外实验结果表明α-松油醇抑制Pdw03生长的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal fungicidal concentration,MFC)均为4.00μL/mL;体内实验研究发现MFC和5 MFCα-松油醇可明显降低接种Pdw03椪柑果实的绿霉病发病率和发病直径;碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色实验发现,经1/2 MICα-松油醇处理后,Pdw03的细胞膜完整性降低,麦角固醇含量显著降低(P<0.05),麦角固醇合成相关基因ERG9表达量显著下调(P<0.05)。综上,α-松油醇通过抑制ERG9基因的表达影响菌株Pdw03的生长,可作为采后柑橘病害防治的有效替代品。

盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制

本实验主要对盐酸小檗碱(berberine hydrochloride,BH)抑制指状青霉(Penicillium digitatum)生长的活性以及可能的作用机制进行探讨。结果表明,BH抑制指状青霉生长的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌质量浓度(minimum fungicidal concentration,MFC)分别为0.16 g/L和0.32 g/L;用MIC的BH处理15 h孢子萌发率仅为(4.40±1.05)%,显著低于对照组((92.48±3.35)%,P <0.05);此外,10 MFC的BH可显著延缓采后柑橘果实绿霉病的发病进程,接种5 d的果实病斑直径为(1.13±0.02)cm,显著低于对照组((5.62±0.09)cm,P<0.05);扫描电子显微镜观察结果表明,BH处理使指状青霉菌丝体褶皱变形。进一步实验发现,BH处理30 min时,指状青霉菌丝体细胞壁完整性和细胞膜通透性受损,胞外碱性磷酸酶活性和可溶性蛋白质量浓度均有所上升,但胞内ATP含量和能荷水平均降低;处理60 min时,活性氧大量积累导致膜脂过氧化,线粒体功能受损,能量代谢进一步失衡。结论:BH能有效抑制指状青霉的孢子萌发和菌丝生长,并延缓柑橘果实绿霉病的发病进程,其抑菌机理可能与影响菌丝体细胞通透性和能量代谢有关。

指状青霉草酰乙酸水解酶的结构特征与原核表达分析

利用生物信息学技术手段分析了柑橘绿霉病病原菌指状青霉(Penicillium digitatum)中草酰乙酸水解酶(Pd OAH)的二级和三级结构,并利用分子生物学技术对重组的Pd OAH进行了原核表达分析和分离纯化。生物信息学分析结果表明Pd OAH的建模结构的质量较高,与其它来源的草酰乙酸水解酶的氨基酸序列具有高度的同源性,且在活性中心氨基酸残基高度保守。重组Pd OAH蛋白在大肠杆菌中进行原核表达,在16℃、0.2 mmol/L IPTG浓度条件下具有较高的表达量,并且有一定的可溶性。利用亲和层析技术分离纯化方法获得了纯度较高的重组Pd OAH蛋白。

不同环境因子对扩展青霉和指状青霉生长和产酸的影响

目的 考察不同环境因子对两种典型果蔬采后致病菌扩展青霉(Penicillium expansum)和指状青霉(Penicillium digitatum)生长和产酸的影响,明确两株青霉菌最佳的生长及产酸条件。方法 本研究在实验室环境下模拟不同营养、温度、pH及光照条件,通过对青霉菌落直径的大小以及培养基pH的变化来评估不同环境因子对扩展青霉和指状青霉生长及产酸的影响。结果 在实验给定的条件下,最适宜扩展青霉生长的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,温度为25℃, pH为6,光照条件为黑暗环境;最适宜扩展青霉产酸的培养基为察氏培养基,温度为25℃, pH为10,光照条件为黑暗环境。最适宜指状青霉生长的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,温度为20℃, pH为4,光照条件为黑暗环境;最适宜指状青霉产酸的培养基为沙氏培养基,温度为20℃, pH为8,光照条件为黑暗环境。结论 两种青霉菌在生长和产酸的最适外界环境条件上有异同点,且指状青霉对温度和pH较扩展青霉更加敏感。