禽流感病毒夹心ELISA快速检测方法的研究

以禽流感病毒(AIV)湖北分离株(H9N2亚型)提纯物为免疫原,制备出鸡抗AIV和兔抗AIV抗体,经用琼脂扩散法测得效价分别为1∶32和1∶16。以纯化的鸡抗AIVIgG为包被抗体,兔抗AIVIgG为第二抗体,建立了检测AIV抗原的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗AIVIgG的最佳包被浓度为1μg/mL,兔抗AIVIgG的最适工作浓度为5μg/mL;对已知的阳性样品,用夹心ELISA法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上,且能检出其它亚型的禽流感病毒;与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡痘病毒、马立克氏病病毒等无交叉反应,说明本方法有很高的特异性及敏感性。对14个鸡场送检的、患有呼吸道疾病或有腹膜炎、眼炎、产蛋下降、怀疑为禽流感感染的病鸡进行了检测,结果有7个鸡场为阳性。本方法的建立为禽流感病鸡群的临床检验提供了一种方便、敏感、快速的检测方法。

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5%福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌InternalinA(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7×105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。

双单抗夹心ELISA方法检测血浆及组织中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的 建立一种敏感、快速的酶免疫测定方法 ,用于定量检测动物体液及组织中金黄色葡萄球菌 (SAU)肠毒素 B(SEB)。方法 采用生物素 -链亲素系统放大的双抗体夹心酶联免疫吸附方法 ,以 SEB单抗 1D2为包被抗体、生物素标记的另一种 SEB单抗 2 D1为标记抗体进行测定。结果 在 0 .0 78～ 10 .0 0 0μg/ L的浓度范围内 ,SEB标准品浓度与吸光度值线性关系良好 ,相关系数为 r=0 .990 6,平均变异系数为 5 .3 2 % ;正常大鼠、家兔和人血浆中的平均回收率分别为 96.43 %、97.3 4%和 19.99% ,正常人尿液中平均回收率为 91.5 3 %。结论 本法灵敏度高、准确性好、稳定性强 ,而且简便、快速 ,适用于动物血浆及组织中微量 SEB的定量测定 。

猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速检测方法,本研究以抗TGEV N蛋白单克隆抗体(MAb)为包被抗体,纯化的抗TGEV N蛋白多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立了TGEV双抗体夹心ELISA方法,优化其反应条件为:抗TGEV N蛋白MAb包被浓度为0.4μg/mL,抗TGEV N蛋白PcAb和酶标二抗的工作浓度分别为3.5μg/mL和1∶5 000,以P/N>2,同时OD490nm≥0.316作为阳性判定标准。该ELISA的重复性变异系数小于10%,与猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪轮状病毒等无交叉反应。对22份临床猪粪便样品RT-PCR的阳性检出率为31.8%;ELISA的阳性检出率为22.7%,二者符合率达81.8%,结果表明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测TGEV具有较高的特异性和敏感性,可以用于TGEV的病原学检测。

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单抗AG1的生物学特性及夹心ELISA诊断方法的建立

用纯化的猪繁殖呼吸综合征病毒沪1株（PRRSV-SI）病毒液作抗原,免疫BALB/C小鼠,获得1株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株,命名为AG1。ELISA交叉试验和阻断试验表明,AGI具有高度特异性。AGI可与PRRSV-S1、美洲株VR-2332、欧洲株LV反应,对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价是1:256～512,腹水效价在1:10-3～10-5之间。AG1有100条染色体,琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b。Western blotting试验表明 AG1是针对 N蛋白抗原表位的特异性单抗。以AG1为捕捉抗原抗体和酶标抗体,建立了快速检测PRRSV抗原的单抗夹心ELISA法,该方法具有快速、灵敏、准确、广谱等特点。

传染性胰坏死病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测,结果双抗体夹心法与RT-PCR法检测符合率为97%,表明本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测IPNV具有较高的敏感性和特异性,可用于IPNV的病原学检测。

卵转铁蛋白双抗夹心ELISA方法的建立

卵转铁蛋白是鸡蛋中的主要过敏原,针对鸡蛋中主要过敏原卵转铁蛋白建立了双抗夹心ELISA方法,该方法检出限为(15.37±1.20)ng/m L。除白蛋白外,该方法对粘蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白、牛奶总蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、花生总蛋白、大豆、杏仁和绿豆等致敏蛋白几乎没有交叉反应。板内重复性和板间重复性较好,因此所建立的方法可用于对卵转铁蛋白的检测。

检测禽流感病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

禽流行性感冒（avian influenza，AI）简称禽流感，是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类传染病。高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）被世界动物卫生组织（world organization for animal health，OIE）列为A类传染病。我国也把禽流感列为一类动物疫病。禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）可感染几乎所有野生禽及家禽，

检测禽副粘病毒2型抗原的双抗体夹心ELISA方法的研究

以禽副粘病毒 2型 (Yucaipa株 )群特异性单抗 7E5为基础建立了检测PMV_2抗原的双抗体夹心ELISA方法。该方法对Yucaipa病毒的最低检出量为 1.6 96 2 μg/ml,对PMV_2不同形式病毒及各分离株也都有很好的检出率。用Yucaipa病毒尿囊液人工感染 10日龄SPF鸡 ,于感染后不同时间采集心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、气管等病科及泄殖腔拭子 ,经处理后用建立的方法进行检测 ,结果表明PMV_2病毒在感染鸡的法氏囊组织内大量存在 ,感染后 3天就可从法氏囊组织内检测到PMV_2病毒 ,粪便中仅个别有检出阳性者。

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立及临床应用

目的 建立检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心ELISA ,探讨其临床应用的可行性。方法 采用不同株Mp单抗 ,用双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原 ,优化该方法检测Mp抗原的最佳实验条件。对Mp标准株及 14 7份临床标本进行测定 ,观察双抗体夹心ELISA方法的敏感度和特异度 ,以及该方法与聚合酶链反应 (PCR)检测法的符合率。结果 包被单抗量为 2 0 μg·ml-1,酶标记单抗 1∶2 0 0稀释时 ,阳性对照与阴性对照吸光度之比 (P/N值 )最大 ;检测Mp抗原敏感度达 2 μg·ml-1,和其它支原体没有交叉反应。 14 7份临床标本PCR检测阳性率为 13 .6% (2 0 /14 7) ;双抗体夹心ELISA法检测阳性率为 12 .2 % (18/14 7) ,两者符合率达 95 .9%。结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本试验以牛乳铁蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了3株稳定分泌乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、3F8和4D3,最后用相对亲和力最强的3C6所产生的抗体作为包被抗体,用辣根过氧化物酶标记过的多克隆抗体作为酶标抗体,最终建立了用于检测牛乳汁中乳铁蛋白含量的双抗夹心ELISA检测方法,该法对牛乳铁蛋白最低检测限为4 ng/m L,最适检测范围为4~256 ng/m L。

相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法的建立与评价

目的建立相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法并进行方法学评价。方法优化最佳相思子毒素多抗包被浓度后建立了相思子毒素双抗夹心ELISA检测方法,鉴定其检测灵敏度、线性范围、特异性、重复性、回收率等。结果双抗夹心ELISA方法检测相思子毒素的最小检出限为1ng/mL,标准曲线在10～100ng/mL范围内线性良好。血清中加入已知量的标准毒素蛋白,测得平均回收率为89%。结论本方法检测相思子毒素的可测范围广、特异性强、灵敏度高、变异系数较小,表明其灵敏、特异、可靠。

双抗夹心酶联免疫(ELISA)方法测定卵类黏蛋白

卵类黏蛋白是鸡蛋中的主要过敏原,因此建立相应的检测方法对保障消费者健康非常重要。为此本试验分别制备了卵类黏蛋白特异性兔多克隆抗体和鼠多克隆抗体,对不同检测条件进行优化,最终建立了一种用于定量分析卵类黏蛋白的双抗夹心ELISA方法,并对检测方法的精密度进行考察。结果表明,通过对封闭液、捕获抗体包被量和检测p H的优化,该方法的最低检出限达到(0.274±1.27)ng/m L,且具有良好的特异性以及检测精密度。因此,所建立的方法可用于食品中卵类黏蛋白的定量检测。

用双抗夹心间接ELISA方法检测p30确证人类精斑

检测p30确证精斑有下列几种方法：免疫扩散，免疫电泳，交叉免疫电泳，胶乳凝集抑制试验，薄层免疫分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些方法各有优缺点，就灵敏度而论，则以酶联免疫吸附试验为高。最近，我们在国家自然科学基金会的资助下，建立了双抗夹心间接ELISA法来确证人类的精斑，获得了满意的结果，现报导如下：

水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用

志贺氏菌(Shigella)通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测志贺氏菌双抗夹心酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法。结果表明:建立的双抗夹心ELISA方法检测曲线的线性范围为4.12×104 cfu/mL~3.4×106 cfu/mL,检测限为4.12×104 cfu/mL;用此体系检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌等无交叉反应;水产品实际样品志贺氏菌检出限(limit of detection,LOD)为105 cfu/mg,具备较好的灵敏性和特异性。

小鼠肝炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立小鼠肝炎病毒（MHV）双抗体夹心ELIsA检测方法。方法将4株特异性抗MHVN蛋白的单克隆抗体进行抗体配对试验确定3D4H9为捕获抗体，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的4G9F2为检测抗体；通过方阵试验确定了3D4H9和4G9F2-HRP的最佳工作浓度分别为12．8ng／mL和70．84ng／mL，以P／N〉2，同时D450nm≥0．248作为阳性临界值的判定。结果该ELISA方法重复性变异系数小于10％，与小鼠细小病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒3型等无交叉反应，对358份血清样品进行检测，与美国EBI公司的间接ELISA试剂盒检测结果无明显差异。结论本研究建立的双抗体夹心ELISA方法检测MHV具有较高的特异性和敏感性，可以用于MHV的病原学检测。

耐药蛋白NDM-1的双抗体夹心ELISA检测方法研究

旨在建立一种检测细菌中新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药蛋白双抗体夹心ELISA方法。采用化学合成的方法获得优化后的NDM-1蛋白基因序列,构建表达载体pET-28a-NDM-1(G29-R270),并在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白。以纯化的NDM-1蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,获得了2株杂交瘤细胞株,分别命名为3H5和4G1,分别作为捕获抗体和检测抗体,通过对包被条件、包被抗体和检测抗体浓度等进行优化,建立双抗体夹心ELISA方法,并对所建立方法的敏感性、特异性等进行了评价。结果表明,经15℃条件下诱导16 h后,SDS-PAGE和Western blot显示目的条带清晰,大小正确。经优化后的双抗体夹心ELISA方法中,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶2 000和1∶5 000,使用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH值9.6),4℃过夜包被。该方法对NDM-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的最低检出浓度为1×10^(5)CFU/mL,NDM-1阳性鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的最低检出浓度为1×10^(6)CFU/mL。该方法检测NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9,与4种阳性对照菌有明显的交叉,但与大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯菌ATCC 10031和铜绿假单胞菌ATCC 9027均无交叉反应。板内变异系数小于6%,板间变异系数小于10%,说明本方法具有良好的重复性。综上所述,本研究建立了一种高特异性和高灵敏的双抗体夹心ELISA方法,为耐碳青霉烯类细菌中NDM-1耐药蛋白检测提供了一种技术手段。

检测蓝耳病病毒的双抗体夹心ELISA方法研究

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪与育肥猪的呼吸困难为特征的一种传染病.