猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法,本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠,按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体,PEDV细胞培养上清为夹心抗原,HRP标记的羊抗猪IgA为二抗,采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法,并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测,结果显示,除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外,其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性,表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测,结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40960,是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2560),表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性猪初乳,评估该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数分别为0.34%~4.49%和1.90%~8.71%,均小于10%,重复性好。利用该捕获ELSIA和IDEXX PEDV IgA抗体试剂盒分别对50份猪初乳检测,结果显示两种方法对样品检测的OD450nm值趋势高度一致,表明该方法检测结果与IDEXX试剂盒相关性强。利用该捕获ELISA和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对100份临床采集的猪初乳样品检测,结果显示二者总体符合率为97.0%。利用该方法对90份免疫背景不同的猪初乳检测,结果显示,未感染PEDV且未免疫PED疫苗的母猪初乳检测结果均为阴性结果,感染了PEDV或接种过PED疫苗的母猪初乳均为阳性结果,检测结果与样品的免疫背景相符。本研究建立的捕获ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,与同类进口产品检测结果符合率高,对临床样品的检测结果与其免疫背景相符。本研究为PEDV感染猪初乳的检测及PED疫苗免疫效力的评价提供了一种新的技术手段。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应。将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率达86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%。阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性。

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测口蹄疫病毒的研究

本研究用纯化的Asial型口蹄疫病毒（Footandmouthdiseasevirus，FMDV）免疫BALB／c小鼠，按常规单克隆抗体技术方法，经筛选获得6株能稳定分泌抗Asial型FMDV单抗的杂交瘤细胞株。以牛抗口蹄疫病毒IgG为捕获抗体，选择一株单抗（184）用辣根过氧化物酶标记（HRP-184）作为检测抗体，建立了检测Asial型FMDV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出0．5859μg纯化Asial型FMDV抗原和2．5×10^3TCID50病毒，对O型FMDV、牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测，均为阴性，无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法，具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可用于Asia1型FMDV的特异性检测。

抗原捕获ELISA对猪瘟的诊断效果

应用抗原捕获ELISA方法分别对现行猪瘟疫苗毒及接种疫苗后产生定型热的兔脾、不同地区可疑猪瘟组织样品进行检测。结果表明 ,ELISA方法对猪瘟强毒组织样品的检测效果良好 ,但对弱毒的检测并不敏感 。

非洲马瘟VP7蛋白多克隆抗体的制备及IgM捕获ELISA检测方法的建立

为建立早期快速检测非洲马瘟抗体的IgM捕获ELISA(MAC-ELISA)方法,本试验利用大肠杆菌表达出具有良好抗原性的VP7蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体,通过优化抗原浓度、血清稀释度及酶标抗体稀释度等,建立了检测非洲马瘟的MAC-ELISA方法,并进行了初步应用。结果表明,利用重组表达的VP7蛋白成功建立了检测非洲马瘟的MAC-ELISA方法。

应用捕获ELISA法早期诊断肾综合征出血热

探讨肾综合征出血热早期诊断方法。方法 :用macELISA、IFAT两种方法同时检测经临床诊断肾综合征出血热病人血清 40份 ,非出血热血清 2 0份 ,正常人血清 2 0份 ,并进行对比研究。而且阳性血清用 2 -巯基乙醇破坏IgM试验 ,阴性血清加类风湿因子阳性血清进行干扰试验。结果 :用macELISA法检测肾综合征出血热病人病程第 2天即可出现阳性 ,第 3～ 4天特异性抗体IgM阳性率达 89% ;第 5～ 7天可达 10 0 % ,而IFAT法同病日抗体阳性率只有 5 5 %与 70 % (P <0 .0 5 )。非出血热病人与正常人特异性抗体全部阴性。阳性血清用 2 -巯基乙醇破坏IgM后macELISA检测为阴性 ;而阴性血清加类风湿阳性血清后再用本法检测无假阳性。结论 :与IFAT法相比 ,macELISA法诊断肾综合征出血热特异性强 ,灵敏度高 ,早期诊断意义大。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）单克隆抗体包被酶标板，以兔多克隆抗体作为夹心抗体，建立BVDV抗原捕获ELISA（AC-ELISA）检测方法，优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明，单抗最佳包被质量浓度为5μg／mL，兔多抗血清最佳质量浓度为10μg／mL；单抗在4℃包被12～24h，多抗在37℃作用1h为双抗体的最佳反应条件；酶标抗体最适稀释度1：10000，最适作用时间为1h；采用1％BSA和1％明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC—ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品，同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比，3种方法符合率很高。研究表明AC—ELISA方法稳定性好，可用于BVDV的临床快速检测。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

研究以纯化的羊抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体作为捕获抗体,抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体为检测抗体,建立草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法,其最佳反应条件是:羊多克隆抗体包埋浓度为2.5μg/m L,抗草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体工作浓度为1:400稀释,以3%牛血清白蛋白作为封闭液。该方法的检测限为5×105 pfu/m L,且能够特异性检出发病草鱼内脏组织中的草鱼呼肠孤病毒。特异性试验结果表明该方法具有较高的特异性,与病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤春血症病毒等水产动物病毒株均不反应。该方法还具有较好的稳定性。

牛轮状病毒抗原捕获ELISA方法的建立与应用

为建立牛轮状病毒(BRV)抗原检测方法,本研究以BRV VP6蛋白的多克隆抗体为捕获抗体、VP7蛋白的G6/G10共享型单克隆抗体(MAb)为检测抗体,建立了BRV抗原捕获ELISA方法。特异性试验结果显示,该ELISA方法与牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒以及阿卡斑病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,本研究建立的ELISA方法最低可以检出10^(4.2) TCID_(50)病毒,而商品化ELISA试剂盒和RT-PCR方法的最低检出限分别为10^(4.86) TCID_(50)和10^(3.36) TCID_(50)病毒。该方法组内和组间的变异系数均小于10%,表明重复性良好。应用该ELISA方法对67份牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BRV阳性率为18%,与商品化试剂盒和RT-PCR方法的符合率均为100%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法可以用于BRV的规模化检测,为BRV的病原流行病学调查研究提供了有效的技术手段。

流行性造血器官坏死病病毒抗原捕获ELISA建立

使用差速离心浓缩的病毒免疫山羊,获得高免血清并提取IgG,即为抗流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)多克隆抗体。利用纯化的EHNV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经有限稀释法亚克隆,获得杂交瘤细胞株。将杂交瘤接种小鼠诱生腹水获得单抗3A4。以抗EHNV多克隆抗体为捕获抗体,单抗3A4为检测抗体,使用HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标二抗,建立了EHNV的抗原捕获ELISA方法。该方法可检出103TCID_(50)的病毒液上清和0.0056!g的MCP重组蛋白。对纯化的GCRV、IHNV、IPNV、VHSV及SVCV病毒液进行检测,结果均为阴性,未发现交叉反应。本研究建立的EHNV抗原捕获ELISA方法,具有敏感、特异和重复性好的特点。通过应用于人工感染样品和临床样品的检测进一步证实了本检测方法的实用性。

捕获ELISA法用于肾综合征出血热早期诊断的研究

目的 探讨肾综合征出血热 (HFRS)早期诊断方法。方法 用MacELISA、IFAT二种方法同时检测HFRS病人血清40份 ;非出血热血清20份 ;正常人血清20份进行对比研究。而且 ,阳性血清用2 -巯基乙醇破坏特异性IgM试验 ,阴性血清加类风湿因子阳性血清干扰试验。 结果 用MacELISA法检测HFRS于病程第2日即可出现特异性IgM阳性 ,3～4病日阳性率达89 % ;5～7病日阳性率达100% ,而IFAT法时病日抗体阳性率为55%与70% (P<0.05)。非出血热病人与正常人特异性抗体全部阴性。阳性血清用2 -巯基乙醇破坏IgM后MacELISA检测为阴性 ,阴性血清加类风湿阳性血清后用本法检测无假阳性。结论 两法相比 ,MacELISA法诊断HFRS特异性强 ,灵敏度高 。

乌鲁木齐地区抗体捕获ELISA法检测孕妇TORCH感染

目的 以抗体捕获ELISA法检测分析乌鲁木齐地区孕妇TORCH感染的情况。方法 采用抗体捕获ELISA法对 2 0 0 0年 5月至 2 0 0 1年 10月来我院产前检查的孕妇 1816例孕妇血清中抗TORCH -IgM抗体进行检测分析。结果 弓形体阳性率 1.16 % ,风疹阳性率 1.82 % ,巨细胞阳性率 2 .5 3% ,单纯疱疹阳性率 0 .94 %。结论 TORCH感染与优生优育有着极为重要的关系 ,准确地监测机体对TORCH病原体的免疫反应是正确治疗和预防的基础。

病毒分离结合荧光抗体技术与抗原捕获ELISA检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原的敏感性比较研究

本研究通过体外增毒,再测定病毒的TCID50,然后将病毒培养物作系列稀释,比较了细胞传两代进行荧光抗体染色法与三种商品化的抗原捕获ELISA试剂盒(包括IDEXX公司生产的BVDV抗原检测试剂盒、POURQUIER生产的P80检测试剂盒及NSP2-3/E0检测试剂盒)检测病毒抗原的敏感性。结果表明,传两代进行荧光抗体染色的方法可检出10-6稀释的50μL细胞毒(0.12个TCID50),而三种商品化进口ELISA试剂盒分别只能达到10-2(1.2×103个TCID50)和10-1(1.2×104个TCID50)稀释的50μL细胞毒。尽管传两代进行荧光抗体染色的方法相对繁琐,但这种方法的敏感性是抗原捕获ELISA难以比拟的,因而更适合于血清中BVDV病毒抗原的检测。

免疫磁性捕获ELISA法检测甘草中甘草蛋白的研究

目的 制备甘草蛋白免疫磁性微球,并建立快速、精确的免疫磁性捕获ELISA法检测甘草蛋白。方法 采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球,并以兔抗甘草蛋白IgG抗体致敏,制备特异性捕获甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体,结合辣根过氧化物酶标亲和素建立ELISA检测系统,用于甘草药材和含甘草中成药中甘草蛋白的分析。结果 利用该方法对甘草药材和中成药中甘草蛋白抗原检测,检测灵敏度达到10ng/mL。结论 免疫磁性捕获ELISA检测技术方便、快速、准确,为生药的品种鉴定及中成药的质量控制提供一种新方法。

应用捕获ELISA检测肾综合征出血热患者尿液中特异性IgM抗体

目的 检测肾综合征出血热患者尿液中特异性IgM抗体 ,研究早期诊断方法。 方法 :用MacELISA法检测不同病日HFRS病人尿液中特异性IgM抗体。 结果 :HFRS病人尿夜中特异性IgM抗体总阳性率为 76.4 7% ,第 3病日即可出现阳性 ,7- 9病日阳性率可达 83 .87% ,与同期HFRS病人血清抗体检测对比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :用MacELISA检测HFRS尿液中特异性IgM抗体敏感性高 ,特异性强 ,适合早期诊断。