猪捷申病毒云南流行株的遗传进化

【目的】了解云南省猪场捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)的感染情况及流行毒株分子进化特征,为预防控制该病提供参考。【方法】从云南曲靖、弥勒和大理的猪场随机采集粪便样品,采用RT-PCR方法对PTV 5′-UTR部分基因片段进行扩增、克隆及测序,通过生物信息学软件进行同源性分析并构建系统进化树。【结果】PTV核酸阳性率达27.3%(32/117),测序后去除重复序列得到6条序列。同源性分析结果显示:株间核苷酸同源性为93.2%~98.9%,与参考序列核苷酸同源性为89.7%~100.0%;系统进化树构建结果显示:YNDL-2和YNDL-3与四川省分离的PTV毒株亲缘关系较近;YNQJ-1与日本分离的PTV毒株亲缘关系较近;YNDL-1、YNQJ-4和YNQJ-5聚为一簇,与多米尼加分离的毒株亲缘关系较近,表明同一猪场存在不同血清型感染。【结论】云南猪场PTV感染率较高,流行株间进化关系差异较大,同一猪场存在不同基因型的病毒感染,未体现出明显的地域性。研究结果为PTV致病机理、疫苗研制及防控等奠定了基础。

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。

检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原,建立了检测PTV抗体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法。该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1∶10;FITC标记二抗最适稀释度为1∶100;二抗中伊文氏兰最适稀释度为1∶30 000。敏感性试验、特异性试验表明该抗原板可以检出包含PTV-8型和1型在内的的所有PTV阳性血清,方法敏感、特异。与SN符合率94.0%。用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1 500份临床血清样品进行检测,阳性检出率为55.8%,表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍。该方法做为PTV的血清学诊断新技术,为开展PTV分子流行病学调查奠定了基础。

猪捷申病毒HB株的分离与全基因序列分析

为分析河北省某规模化猪场猪捷申病毒(PTV)的遗传变异和进化关系,作者成功分离到PTV HB株,对其进行了毒力测定和动物回归试验,设计引物进行了全基因序列测定,并与国内外42株PTV全基因序列进行了同源性比较。结果表明猪捷申病毒HB株病毒滴度为10-6.4 TCID50.mL-1,健康仔猪接毒28d后均出现明显猪捷申病症状,该毒株全基因组序列长度为7 090bp。系统进化树分析表明,猪捷申病毒HB株(JQ664746)属于PTV-8型血清型,和国内分离的PTV-jilin/2003株(GQ293092)同源性最高,从而为进一步研究该毒株的遗传变异提供参考。

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株VP1蛋白的原核表达及其反应原性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株的基因组序列(GenBank登录号:DQ355222)设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了PTV的VP1基因片段,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-VP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子质量为45 ku的融合蛋白,在1.0 mmol/L IPTG诱导6 h后,重组菌的表达效果最好,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的63.4%,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经Ni柱纯化后,薄层扫描显示,目的蛋白的纯度达到了97%。Western-blot结果显示,纯化后的VP1蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,表明,原核表达的VP1蛋白具有良好的反应原性。

猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Erns基因和PTV 5'-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99%、27.54%和56.52%,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35%,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59%,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04%,3种病毒的混合感染检出率为8.70%,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6%。本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03分离株细胞适应性和致病性研究

为确定猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株的易感细胞系及其致病性,本实验将该病毒接种不同细胞,通过细胞病变、电子显微镜观察和PCR技术进行鉴定。并进一步将该病毒回归本动物鉴定其致病性。试验结果表明,PTV Swine/CH/IMH/03对IB-RS-2和PK-15细胞系敏感,能够在IB-RS-2和PK-15细胞系中增殖。致病性试验结果显示,Swine/CH/IMH/03分离株能够导致实验猪出现神经症状,剖检可见脑、肾、脾、肠道发生出血,病理组织学检查可见脑实质内胶质细胞浸润、肾脏间质小血管淤血、脾淋巴细胞减少、小肠伴有出血及淋巴细胞浸润等病理变化,对仔猪具有强致病性。

猪捷申病毒TaqMan实时定量RT-PCR方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)的早期检测及定量分析方法,本研究基于PTV 11个血清型基因组5'端非编码区保守序列,设计引物和TaqMan探针,建立了检测PTV的TaqMan实时定量RT-PCR方法。应用该方法对PTV、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒以及猪瘟病毒进行特异性试验,结果除PTV为阳性外其它均为阴性;针对PTV最低可检测到10个拷贝;批内、批间重复试验的变异系数均小于3%。应用建立的方法与病毒分离方法分别对91份临床样品进行检测,检出率分别为79.12%和57.14%,两者的符合率是78.02%。经临床应用表明,该实时定量RT-PCR方法可为PTV的早期诊断及定量分析提供技术手段。

猪捷申病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

应用PK细胞,从临床症状上表现为腹泻的仔猪肠内容物中分离到一株病毒,对该病毒进行RT-PCR检测,证明该病毒为猪捷申病毒(PTV),命名为PTVJS2013。对该病毒进行细胞半数感染量(TCID50)测定,动物试验以及VP1蛋白基因序列测定,并与国内外16株不同血清型PTV的VP1基因序列进行了同源性比较及系统进化树分析。结果表明,猪捷申病毒JS2013 VP1基因核苷酸与8型血清型PTV同源性达到99.6%。而与其他血清型的PTV VP1基因核苷酸的同源性仅在58.3%~74.7%之间;与国内分离的PTV-Jilin/2003/2(JN710381/PTV-8)和PTV-Fuyu/2009(HQ020378/PTV-8)亲缘关系最近,同属于PTV-8血清型一个分支。

猪捷申病毒检测方法研究进展

猪捷申病(PTD)是危害养猪业的一种重要传染病,论文概述了猪捷申病毒(PTV)实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面,主要依靠病毒分离培养、病毒电镜形态检查、病毒特异性抗原及其抗体的检查等。在分子生物学方面,主要依靠国内外相继建立起的RT-PCR技术和实时荧光定量RT-PCR技术等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性,为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究

为确定猪捷申病毒(Porcine Teschovirus,PTV)Swine/CH/IMH/03株免疫原性,本研究将该PTV分离株灭活后分别与氢氧化铝佐剂和Montanide ISA 50V2佐剂混合,制成油佐剂疫苗,并采用不同免疫程序接种实验猪后对病毒抗体进行检测。抗体检测结果表明:PTV Swine/CH/IMH/03分离株能够诱导实验动物产生较高抗体水平,并显著高于对照组;与氢氧化铝佐剂混合制成的佐剂疫苗免疫效果优于Montanide ISA 50V2佐剂;而且一次免疫组与二次免疫组没有明显差异。通过PTV Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究,为后续猪捷申病的预防工作提供技术支持。

猪捷申病毒分子生物学研究进展

猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)引起的猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种表现的一种病毒性传染病。该病在大多数猪场呈隐性感染,其致病机制、分子机理、与其他病毒的相互作用尚不十分清楚。同时,该病在国内外研究较少。论文主要综述了猪捷申病毒的分子生物学研究进展,并对其研究前景进行了展望。

猪捷申病毒中国株3ABC基因的克隆及序列分析

根据已报道的Swine/CH/IMH/03基因序列设计1对引物,从已分离的中国株捷申病毒中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到3ABC基因.并将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测序,并与GenBank上的14种毒株序列进行比对.结果表明:猪捷申病株中国株(PTV-3ABC)与F65毒株、PTV-1毒株、Swine/CH/IMH/03毒株和Talfan毒株的同源性比较高,分别为96.5%,99.5%和99.4%分别为99.4%,氨基酸同源性分别为95.6%,98.8%,98.4%和98.8%.系统发育树表明,此中国株捷申病毒属于PTV-1型.

猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,该方法仅对PTV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与4.6×10^(8)~4.6×10_(2)拷贝/μL的质粒浓度范围具有良好线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.201×log X+40.527,线性相关系数(R^(2))为0.996,检测下限为4.6×10^(1)拷贝/μL。对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于4.0%,具有良好的重现性。应用所建立的方法对235份临床猪腹泻样品进行检测,PTV阳性样品32份,样品阳性率为13.62%。本试验建立的RT-qPCR方法为PTV实验室检测及病毒研究分析提供了可靠的技术手段。

云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)感染引起的猪的一种病毒性传染病。文章根据Gen Bank收录的PTV基因序列设计套式引物,建立检测PTV的套式RT-PCR诊断方法;从云南省某猪场疑似猪捷申病的病料中检测出PTV核酸阳性,产物经克隆测序,与Gen Bank收录的PTV毒株序列比对,结果表明该扩增序列与PTV同源性为99%~95%,首次在云南确诊了PTV感染存在。

猪捷申病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立可同时检测猪捷申病毒(PTV)与猪圆环病毒2型(PCV2)的双重PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2种病毒的PCR诊断方法,扩增片段长度分别为187 bp(PTV)、120 bp(PCV2)。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PTV、PCV2核酸检测最低浓度分别为2.8×10-2 ng和6.6×10-3 ng。应用该方法对43份临床样品进行检测发现,PTV阳性率为23%,PCV2阳性率为38%,PTV与PCV2共感染率为16%。该方法的成功建立,为快速高效地检测以上2种病毒提供有力手段。

猪捷申病毒的诊断方法

猪捷申病（teschendiseaes）最初发现于捷克的捷申地区，因此而得名，是一种急性的致死性猪传染性疾病，能引起严重的中枢神经系统紊乱，又命名为捷申病毒脑脊髓炎（teschovirusencephalomyelifis），该病是Teschen毒株感染引起，属于猪捷申病毒1型。此病症状呈现多样性：神经系统紊乱、繁殖障碍、肺炎、鼻炎、腹泻、心包炎和心肌炎以及皮肤损伤等。随着猪捷申病的流行，猪捷申病毒强毒逐渐被弱毒取代，临床表现上开始以隐性感染为主，但常与猪的其他疾病混合感染，造成猪的发病甚至死亡。

国内猪群中捷申病毒的感染状况

笔者对2007～2016年间国内猪群中PTV病原学调查的6篇文献汇总发现:(1)被检猪群主要来源于江苏、黑龙江、吉林、上海、广西、河南等6省(市)。(2)样品种类为猪组织样品(心、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、扁桃体、全血)和粪便,PTV在组织中的检出率高于其在粪便中的检出率,存在显著统计学差异。(3)核酸检测PTV的样品阳性率区间为0(0/4)～57.14%(52/91),平均阳性率为28.05%(274/977)。(4)因数据偏少,不能从各时间节点检测结果中分析出国内群中PTV的流行趋势,但其病原学和血清学的高检出率仍值得持续关注。

藏猪源捷申病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪捷申病毒(porcine teschovirus, PTV)的流行及分子特征和遗传演化。用RT-PCR法对2017—2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市14个藏猪场96份粪便样品进行检测,并对全基因组进行序列分析和基因分型。PCR检测结果表明,PTV核酸阳性率为20.8%(20/96,95%CI=13.2%~30.3%),14个规模藏猪场中PTV猪场阳性率为57.1%(8/14,95%CI=28.9%~82.3%),并从2份阳性样本中获得了2条近似全长的PTV全基因组序列,分别命名为SWU-E5-2018和SWU-ZG2-2018,核苷酸序列相似性为83.1%。通过VP1序列分析发现2条序列的血清型分别为3型和6型。通过基因重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象,重组区域位于衣壳蛋白基因P1的552—3 082 nt处。为了进一步研究2条PTV序列的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年,SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。本研究首次对藏猪源PTV进行了初步调查,结果表明藏猪中存在一定程度的PTV感染,为深入研究藏猪源PTV遗传变异及其生物学特性提供了参考依据。

猪捷申病毒swine／CH／IMH／03株免疫原性的研究

为确定猪捷申病毒（Poreine Teschovirus，PTV）Swine／OH／IMH／03株免疫原性，本研究将该PTV分离株灭活后分别与氢氧化铝佐剂和Montanide ISA 50V2佐剂混合，制成油佐剂疫苗，并采用不同免疫程序接种实验猪后对病毒抗体进行检测。抗体检测结果表明：PTVswine／cH／IMH／03分离株能够诱导实验动物产生较高抗体水平，并显著高于对照组；与氢氧化铝佐剂混合制成的佐剂疫苗免疫效果优于Montanide ISA 50V2佐剂；而且一次免疫组与二次免疫组没有明显差异。通过PTV Swine／CH／IMH／03株免疫原性的研究，为后续猪捷申病的预防工作提供技术支持。