片形吸虫排泄分泌产物的研究进展

片形吸虫病(fascioliasis)是由片形吸虫(Fasciolaspp.)感染而引起的一种人兽共患寄生虫病,能引起动物"大批死亡",是影响全球公共卫生和畜牧业经济发展的重要问题。片形吸虫在与宿主长期互作过程中,产生抵抗宿主免疫应答的方法得以在宿主体内保存下来,而片形吸虫生长发育的各个时期的排泄分泌产物(excretory-secretory products,ESP)在其中发挥了重要作用,ESP按功能大致分为氧化应激相关蛋白、能量代谢相关蛋白和蛋白酶体相关蛋白三类。在片形吸虫的免疫逃避中,ESP也发挥了重要作用。因此本文中笔者对其进行综述,旨在为研制新型疫苗或药物提供参考。

华支睾吸虫成虫抗原和排泄分泌产物对T细胞的作用研究

目的观察华支睾吸虫成虫抗原(Crude antigen,CA)、排泄/分泌产物(excretory-secretory products,ESPs)对T细胞的作用。方法体外分离小鼠骨髓细胞诱导分化为未成熟骨髓树突状细胞(immature DC,iDC);磁珠分选仪分选小鼠脾脏细胞的初始CD4+T细胞;流式细胞术检测DC、CD4+T细胞的纯度;抗原刺激DC细胞,实验分为PBS阴性对照组,LPS阳性对照组,CA和ESPs刺激组;负载抗原后的DC细胞与分选的CD4+T细胞共培养72h;Real time-PCR检测T-bet、GATA3mRNA的相对表达量;ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ、IL-4细胞因子的表达量。结果与PBS组相比,ESPs刺激组Tbet、GATA3mRNA表达水平升高(P<0.05),而CA刺激组T-bet、GATA3 mRNA表达水平差异不显著;与PBS组相比,ESPs刺激组细胞因子IFN-γ、IL-4的含量均升高(P<0.05),CA刺激组仅IFN-γ的分泌增高(P<0.05),IL-4无明显变化。结论 CA可能诱导宿主产生Th1型免疫应答,ESPs可能诱导宿主产生Th1型、Th2型免疫应答。

寄生蠕虫排泄分泌产物用于免疫诊断的研究现状

本文对绦虫、吸虫、线虫、丝虫四种寄生蠕虫排泄、分泌产物用于免疫诊断的研究现状作了综述。

吸虫排泄分泌产物成分及其功能的研究进展

吸虫是一类重要的人兽共患寄生虫，不仅影响水产业和家畜业的生产，还严重威胁人类的健康。吸虫的排泄分泌产物（excretory—secretory products，ESP）在虫体致病机制中发挥重要的作用，研究其组成成分和相应的功能对探讨虫体和宿主的相互关系有重要的意义。目前已开展通过蛋白质组学和基因组学的相关技术对ESP的成分进行分离、提纯、重组表达，并在体内、外探讨各生物活性分子的生物活性和免疫调节功能的研究。该文就吸虫排泄分泌产物及功能的国内外研究进展作一综述。

旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物iTRAQ法蛋白质组学分析

目的探究旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物(ESP)中的差异蛋白,分析两者免疫抑制差异的原因和参与包囊形成的潜在功能蛋白。方法收集旋毛虫和伪旋毛虫ESP,采用二喹啉甲酸检测法测定旋毛虫、伪旋毛虫ESP蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质量,对经过超滤管酶解法酶解后的ESP多肽段采用同位素相对定量和绝对定量标记技术(iTRAQ)标记,混合标记后的样品进行液相分离高pH反相色谱和液相串联质谱检测。检测完成后,搜索UniProt数据库中的旋毛虫(Trichinella spiralis)和伪旋毛虫(Trichinella pseiudospiralis)数据库,在可信蛋白(得分80以上)的基础上筛选同源蛋白,比较同源蛋白的差异表达情况。利用QuickGO对差异蛋白进行标准化描述。选取9个差异明显的重要蛋白进行实时荧光定量PCR验证,采用△△Ct法验证基因表达水平。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析结果经iTRAQ标记鉴定出旋毛虫可信蛋白492个,伪旋毛虫535个,可用于定量分析的旋毛虫蛋白193个,伪旋毛虫蛋白164个。旋毛虫/伪旋毛虫同源比对结果显示,表达蛋白上调162个,下调31个。GO分析结果显示,分子功能主要富集在离子结合功能、肽酶活性、氧化还原酶活性和核酸酶活性,分别为45、18、12和8个。在生物过程中,涉及最多的是小分子代谢过程(15个),碳水化合物代谢过程(12个),生物合成过程(12个),DNA代谢过程过程(8个)。差异蛋白涉及的细胞组成成分主要为细胞质和含蛋白质的复合物。KECG分析显示,与硫胺素代谢,鞘糖脂生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成相关的蛋白大部分上调。plancitoxin-1(E5SXW8)、胰蛋白酶(E5SPA7)、胱抑素(E5S387)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(E5SJH4)、5’-核苷酸酶(E5S554)、烯醇酶(E5SQX1)、L-天冬酰胺酶(E5SBA6)蛋白表达和基因转录水平在旋毛虫肌幼虫时期均高于伪旋毛虫(P<0.05);热休克蛋白β-1 (E5RZQ6)、组蛋白H2B (E5S7K8)蛋白表达和基因表达水平在旋毛虫肌幼虫时期低于伪旋毛虫(P<0.05)。结论旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP差异蛋白生物信息学分析提示丝氨酸蛋白酶、胱抑素、plancitoxin-1和14-3-3蛋白等可食能与包嚢形成和免疫调节相关。

华支睾吸虫排泄-分泌产物对小鼠巨噬细胞一氧化氮产生和核转录因子κB活化的影响

目的研究华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)排泄-分泌产物(ESPs)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7一氧化氮(NO)产生与核转录因子κB(NF-κB)活化的影响。方法用20μg/ml华支睾吸虫ESPs水溶性浓缩物及其有机溶剂提取物(ESPs-ex)和0.1μg/ml明尼苏达沙门氏杆菌脂多糖(LPS-SM)分别刺激RAW264.7细胞,未刺激对照组加入等量Hank’s平衡盐缓冲液(HBSS)。实验同时用0.3 mmol/L诱导型一氧化氮合成酶(i NOS)抑制剂SMT作为干预。细胞培养18 h后,用Griess法检测各组细胞培养上清液NO2-浓度。将p Ni Fty2-SEAP质粒转染至4组刺激后RAW264.7细胞,培养18 h后,检测培养上清液中可溶性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的吸光度(A620值),倒置显微镜观察细胞内SEAP催化显色情况。结果经ESPs-ex和LPS-SM刺激后,细胞培养上清液中NO2-浓度分别为(14.30±1.62)和(14.10±2.17)μmol/L,均较未刺激对照组[(7.70±0.95)μmol/L]显著增加(P<0.05);加入SMT后,两组NO2-浓度显著下降,分别为(8.97±0.81)和(4.96±1.36)μmol/L(均P<0.05)。经ESPs刺激后,上清液中NO2-浓度为(4.06±0.62)μmol/L,较未刺激对照组显著降低(P<0.05);加入SMT后,NO2-浓度为(3.99±0.87)μmol/L,无明显变化(P>0.05)。ESPs刺激后,上清液SEAP的A620值为0.836±0.005,显著高于未刺激对照组(0.097±0.009)(P<0.05);镜下可见细胞内出现广泛、强烈的蓝色显色反应。ESPs-ex和LPS刺激后,上清液SEAP的A620值分别为0.112±0.004和0.116±0.009,略高于未刺激对照组(P>0.05);镜下见部分细胞内出现蓝色显色反应。结论华支睾吸虫ESPs能够促进RAW264.7细胞活化NF-κB,其水溶性浓缩物可抑制NO产生,ESPs-ex和LPS-SM可促进NO产生。

大片形吸虫排泄分泌产物对体外培养LO2人肝细胞的影响

目的初步探讨大片形吸虫排泄分泌产物(FgESP)对体外培养LO2人肝细胞的增殖及对肝细胞损伤相关的生化指标的影响。方法将LO2人肝细胞分为5个密度组(1 000、 3 000、 5 000、 7 000、 10 000个/孔),铺于96孔板中,空白对照组只加入培养基,根据LO2细胞生长曲线选择最适细胞铺板密度。在96孔板中,以最适细胞密度铺板,分为0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设4个重复,以PBS作为阴性对照组,在培养箱中孵育4、 8、 12、 24、 48和72 h后进行MTT细胞活性检测,测吸光度(A_(490)值)。在24孔板中,分为0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组,每组设3个重复,以PBS作为阴性对照组,分别在培养4、 8、 12、 24、 48和72 h后,收集LO2细胞上清,测定碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)的含量。采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。结果根据LO2人肝细胞生长曲线,筛选出5 000个/孔为96孔板最佳铺板密度。FgESP作用72 h后, MTT细胞活性检测结果显示, 0.02、 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP等5组的A_(490)值分别为1.29±0.01、 1.28±0.06、1.13±0.08、 0.97±0.06、 0.25±0.01,均低于对照组(1.45±0.05)(P <0.01)。生化指标检测结果显示, 0.40、1.00 mg/ml FgESP作用细胞LO2人肝72 h后, ALT含量分别为2.00±0.00、 3.67±0.58, AST含量分别为5.33±0.58、7.67±0.58,均高于对照组的(P <0.01);作用48 h后, 1.00 mg/ml FgESP组ALT、 AST含量分别为2.00±0.00、7.00±0.00,高于对照组的0.33±0.58、 3.67±0.58 (P <0.01);在12～72 h内, 0.10、 0.20、 0.40、 1.00 mg/ml FgESP作用后ALP含量升高(P <0.01),而0.02 mg/ml FgESP仅在作用72 h后ALP含量升高(P <0.01);各实验组ALB含量与阴性对照组差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 FgESP体外作用可抑制LO2人肝细胞增殖能力,且细胞增殖的抑制及损伤程度与FgESP的浓度相关。

华支睾吸虫排泄/分泌产物对肝纤维化的影响

为了探讨华支睾吸虫排泄/分泌产物(ESPs)对大鼠肝星状细胞(HSCs)的影响,采用不同质量浓度的华支睾吸虫ESPs(CsESPs)处理HSC-T6细胞,利用CCK8法检测CsESPs对HSC-T6细胞活力的影响,并以MCC950预处理细胞作为对照,利用RT-qPCR和Western-blot分别检测细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、α-SMA、Col1α1和Col3α1的基因和蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,25、50和100μg/mL的CsESPs对细胞活力无明显影响;当CsESPs的质量浓度达到50μg/mL时,与对照组相比,NLRP3及其下游的Caspase-1、IL-1β基因的相对表达水平显著升高,HSC-T6细胞激活的标志基因α-SMA及纤维化相关的Col1α1基因的相对表达水平也显著升高;Western-blot结果显示,与对照组相比,50μg/mL的CsESPs可以使HSC-T6细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、α-SMA、Col1α1及Col3α1的蛋白表达水平显著升高,而在MCC950预处理细胞组,这6个指标的基因和蛋白表达水平均被明显抑制。结果表明,CsESPs可以使HSC-T6细胞活化,诱导细胞内NLRP3炎性小体活化及胶原表达,NLRP3炎性小体活化是华支睾吸虫感染所致肝纤维化的关键环节之一。

华支睾吸虫成虫粗抗原及ESP促肝星状细胞活化效果比较

目的研究华支睾吸虫分泌排泄产物(Cs.ESP)及虫体粗抗原(Cs.CA)对小鼠原代肝星状细胞活化的影响。方法分离小鼠原代肝星状细胞,鉴定后进行体外培养。实验分组为Cs.ESP刺激组和Cs.CA刺激组,同时设立空白对照组;采用RT-PCR检测肝星状细胞活化指标Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的mRNA转录水平,采用Western blot检测CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达情况。结果Cs.ESP刺激组较Cs.CA刺激组和空白对照组的CollagenⅠ、α-SMA的mRNA转录水平及蛋白表达水平均上调,差异均有统计学意义(P<0.05),而Cs.CA刺激组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论Cs.ESP可促进体外培养的肝星状细胞活化,而Cs.CA对其活化无明显作用,为后续华支睾吸虫致肝纤维化的细胞分子机制研究提供参考。

大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体mRNA表达量的影响

目的研究大片形吸虫感染及其分泌排泄产物对小鼠Toll样受体(TLRs) m RNA表达量的影响。方法 40只雌性BALB/c小鼠随机分为感染组和未感染组,每组20只。感染组每鼠经口灌喂大片形吸虫嚢蚴20个,未感染组经口灌喂等体积PBS,分别于感染后1、 4、 7、 14和28 d,每组各取4只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1~9 mRNA的相对表达量。于感染的水牛肝脏中收集大片形吸虫虫体, PBS培养6 h,收集自然活性的大片形吸虫分泌排泄产物(n Fg ESP)。18只雌性BALB/c小鼠随机分为n Fg ESP组和PBS组,每组9只。n Fg ESP组每鼠经腹腔注射1 mg/ml n Fg ESP,对照组注射等量PBS,分别于注射后1、 4、 7 d,每组各取3只小鼠进行剖杀。取小鼠肝脏组织,提取总RNA,逆转录为cDNA, qRT-PCR检测TLR1~9 m RNA的相对表达量。将n Fg ESP溶液95℃热处理15 min,制备热灭活的大片形吸虫分泌排泄产物(hi Fg ESP);分别用含25、50、 100和200μg/ml n Fg ESP或hi Fg ESP的PBS体外刺激小鼠RAW264.7细胞24 h (细胞浓度为2×106个细胞/孔),设2个重复孔, 3次重复实验,以等体积PBS为空白对照;收集各组细胞,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA, q RTPCR检测TLR1~9 mRNA的相对表达量。结果大片形吸虫感染小鼠实验结果显示,感染组小鼠7 d后肝脏组织中TLR6和TLR7的mRNA相对表达量分别为2.9±0.3和2.5±0.5,均高于未感染组(1.0±0.2和1.3±0.5)(P <0.01);14 d后TLR1和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.4±0.8和2.8±0.9,均高于未感染组(1.1±0.2和1.1±0.3)(P <0.05或P <0.01);28 d后TLR1、 TLR8和TLR9的mRNA相对表达量分别为3.8±1.3、 4.2±1.5和3.1±0.9,均高于未感染组(1.0±0.2、 1.2±0.4和1.1±0.3)(P <0.01或P <0.05)。Fg ESP体内免疫小鼠实验结果显示, n Fg ESP注射1 d后,小鼠肝脏组织中TLR1和TLR2的mRNA相对表达量分别为2.5±0.4和1.9±0.4,均高于PBS组(1.0±0.1)(P <0.05或P <0.01)。Fg ESP体外刺激RAW264.7细胞实验结果显示, 100μg/ml n Fg ESP刺激下的TLR1、 TLR3、 TLR7和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.6±0.0、 1.4±0.0、 1.6±0.0和1.9±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.05或P <0.01);200μg/ml n Fg ESP和hi Fg ESP刺激下的TLR8 mRNA相对表达量分别为3.4±0.0和4.0±0.5,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01);100μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR2和TLR8的mRNA相对表达量分别为1.5±0.1和2.0±0.0,均高于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01);25μg/ml hi Fg ESP刺激下的TLR3m RNA相对表达量为0.6±0.0,低于PBS组(1.0±0.0)(P <0.01)。结论大片形吸虫可能通过其分泌排泄产物影响小鼠TLR1、 TLR7和TLR8的转录,对宿主免疫应答进行调控。

旋毛虫成虫排泄分泌物对中性粒细胞功能的影响

利用激光共聚焦显微镜和实时荧光定量PCR等技术,探究旋毛虫成虫排泄分泌物(核酸酶抑制剂ATA阻断DNase酶活性条件下)对中性粒细胞胞外诱捕网形成、活性氧生成和细胞因子产生的影响。结果显示,旋毛虫成虫排泄分泌物能够抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成,减少活性氧生成,促进细胞因子IL-1β、IL-10和TNF-α的表达,降低IL-4的表达,对IFN-γ表达水平无明显影响。结果表明,旋毛虫排泄分泌物能够影响中性粒细胞的功能,为进一步研究旋毛虫免疫逃避机制等奠定良好基础。

免疫印迹分析试验感染肝片吸虫和大片吸虫绵羊的IgG应答

免疫印迹(Westernblot)分析试验感染肝片吸虫和大片吸虫绵羊的抗片形吸虫分泌排泄产物(FhESP和FgESP)IgG应答,结果表明,FhESP中分子质量在17.1～21.6ku之间的4条主要蛋白带仅被肝片吸虫感染以后(0WPI以后)的血清识别且不被对照组血清识别;FgESP中分子质量在19.0～71.1ku之间的6条主要蛋白带仅被大片吸虫感染以后(0WPI以后)的血清识别且不被对照组血清识别。

蠕虫感染与肿瘤发生关系的研究进展

感染被认为是导致肿瘤发生的主要因素之一,约17%的肿瘤患者可归因于慢性感染。近年来有研究发现许多寄生蠕虫感染与肿瘤的发生发展密切相关。寄生蠕虫与肿瘤关系复杂,部分寄生蠕虫可以通过机械损伤、分泌排泄产物刺激、基因突变等方式促进肿瘤的发生,还有部分寄生蠕虫可以通过增强人体免疫反应从而发挥抗肿瘤效应。本文对几种常见的寄生蠕虫感染与肿瘤发生的关系及蠕虫感染诱发肿瘤的发病机制进行综述。

豆状囊尾蚴小胞外囊泡可抑制家兔外周血淋巴细胞NLRP3活化

本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔,分离不同感染时期的外周血淋巴细胞(PBLC),检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时,收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物(ESP),并通过超速离心分离小胞外囊泡,用ESP和小胞外囊泡分别处理PBLC,24小时后,利用qPCR和Western-blot分析炎症小体相关基因的表达变化。结果显示,家兔感染后第30天和60天,炎症小体相关基因NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显升高,而在感染第90天时明显下降;用ESP处理PBLC后,NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平也明显升高;而用小胞外囊泡处理细胞后,虽然IL-1β的表达水平升高,但NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显受到了抑制。说明豆状囊尾蚴可通过其ESP或小胞外囊泡调控家兔PBLC炎症小体的活化,从而达到其长期生存和持续感染的目的。

大片吸虫ESP对水牛外周血单核/巨噬细胞NO表达的影响

为探讨水牛易感大片吸虫的免疫机理,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离水牛外周血单个核细胞,再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞,用Geriss法检测在大片吸虫分泌排泄产物(ESP)或脂多糖(LPS)作用下,水牛外周血单核/巨噬细胞一氧化氮(NO)的表达量。结果显示,大片吸虫ESP或LPS都可单独作用刺激水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO。大片吸虫ESP(0.1、1μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量低于LPS(0.1μg/mL)单独作用时的量,差异显著(P<0.05)。大片吸虫ESP(10μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量与LPS(0.1μg/mL)单独作用时差异不显著(P>0.05)。结果表明,大片吸虫ESP或其中组分能抑制水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的作用,这可能是水牛易感大片吸虫的一个原因。