高效液相体积排阻色谱法测定口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量及疫苗质量评估

【背景】口蹄疫疫苗质量评价方法对疫苗生产企业和监管部门进行质量控制尤为重要,146S抗原含量是评价口蹄疫疫苗质量的关键指标。蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient centrifugation,SDGC)是公认经典的测定口蹄疫146S抗原含量的方法,但存在检测耗时长、过程复杂、重复性差等缺点,影响了疫苗的质量监测。口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量高效液相体积排阻色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SE-HPLC)是一种简便、快速、自动化程度高、高效的测定方法。【目的】在初步建立的采用SE-HPLC测定口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量方法的基础上,针对不同类型、不同浓缩纯化生产工艺制备的口蹄疫灭活疫苗,进一步确认SE-HPLC法在检测过程中的普适性势在必行。【方法】利用口蹄疫146S抗原标准品建立SE-HPLC法标准曲线,求得回归方程,用于检测样品的146S含量。采用SE-HPLC法和SDGC法分别检测146S抗原标准品1倍、2倍、4倍、8倍、16倍稀释的5个样品和市场上随机选取的22批疫苗,计算146S抗原含量,对比分析两种方法的相关性。用SE-HPLC法,3次重复检测不同企业生产的134批口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量,通过色谱图特异性、检测值相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分析SE-HPLC法的重复性,评价该方法的适用性,分析市场流通疫苗的总体质量情况。【结果】SE-HPLC法建立的标准曲线,峰面积与146S抗原含量的线性关系良好(R^2=0.9981,n=8)。口蹄疫146S抗原标准品5个稀释样品和22批口蹄疫疫苗的146S抗原含量检测结果表明,口蹄疫146S抗原含量检测SDGC法和SE-HPLC法高度正相关(RS^2=0.9994,nS=5;Rv 2=0.9602,nv=22)。134批口蹄疫灭活疫苗中,146S抗原含量相对标准偏差RSD<5%的疫苗批次分别占疫苗总批次(134批)、单价苗总批次(18批)、双组分及双价苗总批次(76批)、三价苗总批次(40批)的81.34%、72.22%、85.53%、80.00%;146S抗原含量相对标准偏差RSD≤10%的疫苗批次占疫苗总批次(134批)的97.76%。口蹄疫146S抗原含量SE-HPLC法检测重复性良好,其中疫苗146S抗原含量2—4μg·mL^-1时,检测重复性最好。所有批次疫苗均检测到目的峰,目的峰的平均起峰、最高峰、落峰时间分别为SE-HPLC法进样后的11.58、12.90、14.93min,平均持续3.36min。134批口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量为1.11—80.36μg·mL^-1,其中单价苗、双价苗、双组分苗、三价苗146S抗原含量均值分别为2.07、2.40、2.85、13.14μg·mL^-1。【结论】口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量SE-HPLC法适用性好、重复性高、高效、快速、简便,能够用于检测不同类型的口蹄疫灭活疫苗,从而进行疫苗的质量监测和评估。市场流通的口蹄疫灭活疫苗146S含量较高,疫苗质量较好。

高效分子排阻色谱法测定头孢西丁钠中高分子杂质的含量

目的建立高效分子排阻色谱法测定头孢西丁钠的高分子杂质。方法采用TSK-G2000SWxl（7.8 mm×30cm,5μm）柱,流动相为磷酸盐缓冲液-乙腈（95：5）,检测波长235 nm,流速0.8 mL min-1,以头孢西丁对照品外标法计算高分子杂质的含量。结果头孢西丁对照品浓度在0.054 4~0.001 1 mg mL-1与其峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 2）。结论本方法简便快速,定量准确,重现性好,可用于头孢西丁钠高分子杂质的含量测定。

体积排阻色谱法研究变性溶菌酶分子复性过程中集聚体的形成

在体积排阻色谱柱上研究了还原剂存在时脲和盐酸胍变性的 3种溶菌酶溶液的复性和分离过程。当变性液中原始溶菌酶浓度大于 10g/L时,变性溶菌酶在体积排阻色谱柱上除了复性为与未变性溶菌酶出峰时间相同的复性态溶菌酶分子外,还形成了溶菌酶折叠中间体的二分子集聚体。这个结果得到了用稀释法复性时溶菌酶的蛋白电泳检测结果的支持。与稀释法复性相比较,用体积排阻色谱法复性时所形成的折叠中间体二分子集聚体的量要远远低于用稀释法所形成的集聚体的量。

离子排阻色谱法测定啤酒和饮料中有机酸研究

目的：建立啤酒和饮料中草酸、柠檬酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、反乌头酸、乳酸、戊二酸和富马酸等9种有机酸的离子排阻色谱测定方法。方法：采用离子排斥色谱法,利用Rezex ROA有机酸分析色谱柱,以0.005 mol/L硫酸溶液为淋洗液,流速0.3 ml/min,采用紫外波长210 nm进行检测,外标法定量。结果：各种有机酸在相应的试验浓度范围内均具有良好的线性关系,其相关系数均大于0.9990,最低检出限在0.004-2.0 mg/L范围,平均回收率在80.0%-103.6%之间,RSD均小于5.0%。结论：该法具有简单、准确、灵敏等优点,适合啤酒和饮料中各种有机酸含量的检测。

分子排阻色谱法测定头孢克肟聚合物

目的:建立用分子排阻色谱法分析头孢克肟高分子聚合物的方法。方法:采用SephadexG10色谱柱(300 mm×16mm,40～120μm),流动相A为0.1 mol·L^(-1)磷酸盐缓冲液(pH 7.0),流动相B为超纯水,流速1.5 ml·min^(-1),检测波长:254nm。结果:头孢克肟在5～80 mg·ml^(-1)范围内与头孢克肟高分子聚合物的峰面积呈良好的线形关系(r=0.999 3)。头孢克肟在5～400μg·ml^(-1)的范围内与头孢克肟缔合物的峰面积也呈良好的线性关系(r=0.999 7)。结论:该方法能较好地分离头孢克肟与其聚合物,且精密度、准确度均能满足质量控制的要求。

高效液相体积排阻色谱法分析黄秋葵多糖的单糖组成

采用高效液相(HPSEC-RID)体积排阻色谱法,建立了7种常见单糖的分离模式,成功地用于黄秋葵多糖的单糖组成分析。应用体积排阻色谱法,色谱柱为Polyspher CH PB(7.8 mm×300 mm,made in Germany),流动相为去离子水,柱温80℃,示差折光检测器(检测器温度40℃),流速0.6 ml/min内标为丙三醇。根据建立的方法测定,黄秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7种单糖组成,其摩尔比分别为0.57∶1.00∶0.53∶3.50∶1.75∶1.25∶1.70。该HPSEC-RID方法是简单、快速、灵敏、方便的分析技术,具有良好的重复性,可用于黄秋葵多糖的单糖组成的质量控制。

利用体积排阻色谱法进行蛋白质折叠

以溶菌酶为模拟体系对体积排阻色谱法进行蛋白质折叠过程实验研究 .圆二色性光谱法分析结果证实了复性溶菌酶与天然溶菌酶的二级结构一致性 ;复性溶菌酶与天然溶菌酶色谱保留体积的差异揭示出折叠过程中无活性蛋白质聚集体的存在及其向复性蛋白质转化的机制 ;不同初始浓度的复性实验证实了蛋白质聚集体的存在及其与变性蛋白质初始浓度的关系 ;采用短色谱柱的折叠分离实验结果表明蛋白质折叠是一个快速过程 ;不同尿素浓度下的折叠分离实验结果表明尿素在SEC法中具有非常重要的作用 .与稀释复性法的对比实验表明 :体积排阻色谱法具有稀释倍数小、复性产品活性收率高、复性蛋白质浓度高等优点 .

高效分子排阻色谱法测定头孢拉定胶囊中的聚合物

目的建立高效分子排阻色谱法测定头孢拉定胶囊中聚合物的方法。方法用TSKG2000SW色谱柱(7.8mm×300mm),紫外254nm检测,以头孢拉定对照品外标法计算聚合物含量,并与《中国药典》2005年版头孢拉定原料药中聚合物测定方法进行比较。结果本方法测定头孢拉定胶囊中聚合物的平均含量为1.0%,显著高于《中国药典》2005年版方法测定结果。结论高效分子排阻色谱法测定灵敏度高,准确性好,分析速度快,可有效控制头孢拉定胶囊中聚合物的含量。

高效分子排阻色谱法测定滇黄精多糖的分子量

目的建立测定滇黄精多糖分子量的高效分子排阻色谱法。方法色谱柱采用TSK G3000 PWXL凝胶柱(300 mm×7.8 mm,10μm),配有Shodex RI-101型示差检测器,检测波长为210 nm,流动相为纯水,流速为0.5 m L/min,柱温为30℃,进样量为20μL。结果葡聚糖对照品重均分子量(Mw)的线性范围为10.0×10^(3)~200×10^(3)。滇黄精多糖组分PK-F1和PK-F2中多糖主峰P1的保留时间(t_(R))为10.55 min,Mw为145850;多糖主峰P2的t_(R)为12.78 min,Mw为24565。滇黄精多糖组分PK-F3多糖主峰P3的t_(R)为16.91 min,Mw为907。结论该方法简易、准确、可靠,可为滇黄精的质量控制提供参考。

高效分子排阻色谱法测定比阿培南中聚合物杂质

目的建立高效分子排阻色谱法（HPSEC）对比阿培南中的聚合物杂质进行分离分析，并采用液－质（LC-MS）联用的方法确定其分子量，进行初步研究。方法采用Protein－Park^TM 60（7．8mm×300mm，10μm）色谱柱，流动相为5mmol／L的乙酸铵溶液，流速为0．5mL／min，检测波长为220nm，进样量为20μL。用LC-MS法测定聚合物杂质分子量。结果采用HPSEC法，比阿培南聚合物杂质与比阿培南能完全分离，聚合物杂质在含比阿培南0．06-0．16mg／mL浓度范围内线性关系良好（r=0．9991），重复性较好（RSD=1．6％，n=6）。采用LC-MS法推断聚合物杂质主要是比阿培南的二聚物和三聚物。结论HPSEC法简便、灵敏、重复性好，适用于比阿培南中聚合物杂质的测定。

蛋白质复性的分子排阻色谱法的研究进展

包涵体蛋白质复性是生物工程下游技术中的一个重要问题。利用传统的方法复性复性率低和步骤繁琐 ,无法用于大规模生产。最近出现的层析复性方法 ,具有较强的优势。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化 ,使变性蛋白质在层析柱上折叠为正确的空间构象 ,在洗脱的同时实现部分纯化。在层析技术中分子排阻色谱法由于操作简便 ,复性效率高 ,成为研究的重点。文章就分子排阻色谱法的研究情况作一综述。

高效分子排阻色谱法测定头孢呋辛酯片中的高分子量杂质

目的建立头孢呋辛酯片高分子量杂质的检查方法。方法采用TSK-GEL G2000HHR色谱柱(7.8mm×300mm,5μm),流动相为含30mmol/L溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺溶液,流速0.33m L/min,检测波长278nm。结果对该分析方法的专属性、精密度、线性与范围、灵敏度、重复性等进行考查,各项指标均良好;3批头孢呋辛酯片样品高分子量杂质的含量分别为0.45%、0.41%和0.45%。结论该法简便、准确、专属性高,可用于头孢呋辛酯片中高分子量杂质的检查。

高效分子排阻色谱法测定丙二醇头孢曲嗪原料药中聚合物的含量

目的：建立测定丙二醇头孢曲嗪原料药中聚合物含量的方法。方法：采用高效分子排阻色谱法。色谱柱为SephadexG-10，流动相A为0.01mol/L磷酸盐缓冲液[0.01mol/L磷酸氢二钠溶液-0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（61∶39，V/V）]（pH7.0），流动相B为水，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，柱温为30℃，进样量为200μl。结果：丙二醇头孢曲嗪原料药中聚合物的检测质量浓度线性范围为2.07～103.30μg/ml（r＝0.9994）；定量限为10.4ng、检测限为4.1ng；精密度、重复性试验的RSD＜3％。结论：该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可用于丙二醇头孢曲嗪原料药中聚合物的含量测定。

分子排阻色谱法检测双黄连注射液中的高分子杂质

目的分子排阻色谱法考察双黄连注射液中高分子杂质。方法采用分子排阻色谱法测定了3个厂家6批双黄连注射液,用TSKk-GEL G2000SWxL色谱柱,以乙腈-水-三氟乙酸(体积比40∶60∶0.07)为流动相,流速为0.5 mL·min-1,柱温为30℃,二极管阵列检测器,检测波长为214 nm。结果相对分子质量对数与出峰时间呈良好的线性关系(r=0.996 8),相对分子质量对照品(人胰岛素)检出限为0.386 mg·L-1,6批双黄连注射液中均未检出高分子物质,加速稳定性试验检测相对分子质量3 108>Mr≥1 638杂质的含量稳定。结论国内的双黄连注射液质量稳定,在加速稳定性试验中无高分子物质聚合产生,作者建立的检测方法可用于双黄连注射液中高分子杂质的检查。

用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的热稳定性

用尺寸排阻色谱Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ２５０ 凝胶过滤柱研究了核糖核酸酶Ａ、马心肌红蛋白和溶菌酶的热稳定性。测定了蛋白质在尺寸排阻系统中的分配系数Ｋｄ，并用荧光检测器分析了加热引起的蛋白质内源性荧光的改变，从而计算出了蛋白质的热变性转化点温度。测量了蛋白质天然态、热变性和盐酸胍诱导变性状态下的斯托克斯半径，实验结果进一步证实了热变性后蛋白质不是呈真正的随机线状，而是保留了部分紧密的结构区域。

分子排阻色谱法测定马罗匹坦注射液中磺丁倍他环糊精钠的含量

[目的]建立马罗匹坦注射液中磺丁倍他环糊精钠的含量测定方法。[方法]采用分子排阻色谱法,以0.1 mol/L硝酸钾溶液-甲醇（65∶35）为流动相,采用分子排阻色谱法检测马罗匹注射液中磺丁倍他环糊精钠的含量。[结果]磺丁倍他环糊精钠与相邻峰的分离度均大于3.0;在6-180μg范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系（r=0.999 9,n=8）;在80%、100%、120%3种添加水平下的平均回收率分别为95.96%（RSD=0.5%,n=3）、98.41%（RSD=0.4%,n=3）、97.77%（RSD=0.5%,n=3）。[结论]该方法专属性强、准确度好、适应范围宽,可作为马罗匹坦注射液中磺丁倍他环糊精钠的含量测定方法。

体积排阻色谱法在药物蛋白检测中的应用

探讨了单克隆抗体A、抗体融合蛋白B两种蛋白在不同的体积排阻色谱柱上的分离效果及流动相条件对体积排阻色谱柱分离抗体融合蛋白B的影响。结果表明,分析抗体融合蛋白B纯度和相对分子质量需要正确选择体积排阻色谱柱和合适的流动相条件。

分子排阻色谱法测定水解蛋白注射液中高分子物质

目的:采用分子排阻色谱法测定水解蛋白注射液中小分子肽的分子量。方法:采用TSK-GEL G2000SWXL色谱柱(7.8mm×300 mm,5μm),以磷酸盐缓冲液(pH 6.8)(含0.1 mol.L-1Na2SO4与0.05%NaN3)为流动相,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。结果:水解蛋白注射液中分子量大于胰岛素的高分子物质含量均在5%以下。结论:该方法简单,重现性好,可以作为控制水解蛋白注射液中高分子物质的方法。

体积排阻色谱法分离单克隆抗体的条件优化

探讨了流动相条件及流速对体积排阻色谱分离抗EGF单克隆抗体的影响.结果表明:选择100mmol/L磷酸钠-150mmol/L氯化钠(pH=7.0)为流动相,设定流速为0.6mL/min时,抗EGF单克隆抗体在体积排阻色谱柱上的分离能获得最佳柱效.

体积排阻色谱法测定介孔材料的孔结构

分别合成了球形的苯基桥键和乙烷桥键两种新型杂化介孔材料。选用已知平均相对分子质量且具有窄相对分子质量分布的葡聚糖为探针溶质,采用动态光散射法测定了粒径,与经验公式计算结果接近。通过体积排阻法对两种材料的孔隙率和孔径分布进行测定并与氮气吸附法结果进行比较,实现介孔材料孔结构快速测定。结果表明,体积排阻色谱法测定苯基桥键和乙烷桥键材料的平均孔径分别为1.14和2.08 nm,而氮气吸附法测定值分别为3.15和3.80 nm,可能是材料在水相介质中表面水合作用的结果,该方法能够更加准确反映色谱实际过程中孔径分布,同时该类新型介孔材料作为体积排阻色谱填料也表现出其优势。