以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的构建

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒ）作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８，该基因的转录和翻译起始区以及５’－端编码区两个密码子均被除去，载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２。

启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建及BCG启动子片段的分离

卡介苗(Bacille de Calmette-Guerin,BCG)是世界上应用最广泛的菌苗,而且也是最安全,最稳定的疫苗,还是目前所知最强的免疫佐剂之一。由于在免疫学上具有许多独特优点,如:可研制成活菌苗、提高免疫力、延长保护期、适合表达免疫原性弱的抗原基因、方便、成本低等,使卡介苗在90年代迅速成为基因工程疫苗研究中的热点。 要将BCG改造成为活的重组多价疫苗载体,集佐剂与抗原于一身,就需要在分枝杆菌中建立与E.coil类似的基因转化系统。

启动子克隆方法研究进展

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术,像I-PCR、P-PCR、SSP-PCR、YADE、TAIL-PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。对这几种方法进行了简要综述,比较了不同方法的优缺点,并展望了今后的研究前景。

粗毛栓菌(Trametes gallic)基因启动子的分离与鉴定

粗毛栓菌 (Trametesgallic)总DNA经Sau3AI酶切后插入到启动子探针型载体pSUPV8的BamHI位点 ,在含氨苄青霉素与潮霉素双抗平板上筛选到 8个潮霉素抗性(Hygr)重组子 (命名为 pTP1～ 8) ,其插入片段大小为 0 .5～ 1.7kb ,抗性水平为 0 .15× 10 - 3 ～0 .35× 10 - 3 g/mL .对 pTP6进行酶切分析表明 ,插入片段中含有KpnI ,XbaI和SacI位点各一个 ,用限制酶SacI和XbaI去掉其 5’端 0 .7kb和 1.2kb片段后 ,其潮霉素抗性由 0 .2 5×10 - 3 g/mL均降为 0 .15× 10 - 3 g/mL .将TP5片段与粗毛栓菌总DNA进行Southern杂交 ,结果证明 ,TP5片段来源于粗毛栓菌总DNA .对片段TP5的 3’端进行序列分析 。

丝状真菌斜卧青霉JUA-10具有启动子功能的DNA片段的克隆与表达

将斜卧青霉JUA - 10染色体DNA的BamHI或PstI片段连接到大肠杆菌的启动子探针型载体pSUPV4上 ,克隆了 7个不同大小的具有启动子功能的DNA片段。卡那霉素抗性试验表明 ,含重组质粒的大肠杆菌均能耐受 10 0 μg/ml以上的卡那霉素 ,最高可达 110 0 μg/ml。说明斜卧青霉的某些DNA片段能在大肠杆菌中有效地启动基因表达。取抗性水平最高的 pPdsuI进一步进行限制酶谱分析 ,表明插入片段的分子量为 2 .4Kb。