基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

微滴数字聚合酶链反应法检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

目的探讨微滴数字聚合酶链反应法(ddPCR)检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床价值。方法收集2015年5月至2017年4月在北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌患者共136例,突变扩增系统(ARMS)检测肺癌肿瘤组织中EGFR基因突变情况;ddPCR和ARMS技术检测血浆中EGFR的基因突变情况。EGFR敏感突变患者均接受比较不同检测技术的符合率,EGFR敏感突变患者一线接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)口服治疗。通过生存分析比较不同技术检测EGFR基因突变患者无进展生存时间(PFS)。结果136例肺癌肿瘤组织样本中,共检测到111例EGFR敏感突变(81.6%),其中含Exon21 L858R突变48例(43.2%),含Exonl9 del突变59例(53.2%),其他突变4例(3.6%)。ARMS检测血浆EGFR基因突变的敏感度为58.6%,特异度为96.0%。ddPCR检测血浆EGFR突变的敏感度为79.3%,特异度为100%,与肿瘤组织检测的符合率达83.1%(Kappa=0.685,P<0.001).Kaplan-Meier生存分析显示,在组织检测EGFR基因突变的亚组分析中,与单一技术检测阳性的病例相比,ddPCR和ARMS两种技术均为阳性的患者无进展生存时间最短(11.6个月比14.8个月,Х^2=2.517,P=0.026).结论作为一种可靠的、高敏感度和特异度的技术,ddPCR有望应用于检测血浆ctDNA EGFR基因突变情况.血液检测EGFR基因突变可预测患者对EGFR-TKI的疗效.

微滴数字聚合酶链反应法检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

目的 探讨微滴数字聚合酶链反应法（ddPCR）检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸（ctDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的临床价值.方法 收集2015年5月至2017年4月在北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌患者共136例,突变扩增系统（ARMS）检测肺癌肿瘤组织中EGFR基因突变情况;ddPCR和ARMS技术检测血浆中EGFR的基因突变情况.EGFR敏感突变患者均接受比较不同检测技术的符合率.EGFR敏感突变患者一线接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）口服治疗.通过生存分析比较不同技术检测EGFR基因突变患者无进展生存时间（PFS）.结果 136例肺癌肿瘤组织样本中,共检测到111例EGFR敏感突变（81.6％）,其中含Exon21 L858R突变48例（43.2％）,含Exon19 del突变59例（53.2％）,其他突变4例（3.6％）.ARMS检测血浆EGFR基因突变的敏感度为58.6％,特异度为96.0％.ddPCR检测血浆EGFR突变的敏感度为79.3％,特异度为100％,与肿瘤组织检测的符合率达83.1％（Kappa=0.685,P〈0.001）.Kaplan-Meier生存分析显示,在组织检测EGFR基因突变的亚组分析中,与单一技术检测阳性的病例相比,ddPCR和ARMS两种技术均为阳性的患者无进展生存时间最短（11.6个月比14.8个月,χ^2=2.517,P=0.026）.结论 作为一种可靠的、高敏感度和特异度的技术,ddPCR有望应用于检测血浆ctDNA EGFR基因突变情况,血液检测EGFR基因突变可预测患者对EGFR-TKI的疗效.

ARMS法在检测肺癌晚期患者肿瘤组织和血浆表皮生长因子受体基因突变中的应用

目的 应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应（ARMS-PCR）检测晚期肺癌患者血清游离DNA和肿瘤组织中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变,探索两者间的一致性。方法 同时收集53例未经治疗的肺癌Ⅲb～Ⅳ期患者的原发灶肿瘤组织和外周血,分别提取DNA,采用ARMS-PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和21外显子突变,对结果不一致的标本用微滴式数字PCR法对外周血标本进行验证。结果 血浆EGFR基因突变检测的灵敏度为51.4%（17/33）,特异度为100%;血浆EGFR基因的突变率为29.4%;16例血浆和组织结果不一致的标本,数字PCR检测的结果与血浆游离DNA检测的结果一致。结论 血浆游离DNA为监测Ⅲb～Ⅳ期肺癌患者原发肿瘤中EGFR基因突变提供了新的来源,ARMS法是检测血浆游离DNA中EGFR基因突变的可靠有效方法。

907例非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变分析

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变特点及与临床特征的关系。方法收集907例NSCLC肿瘤组织,分别提取DNA,采用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)扩增EGFR基因29种突变。结果 907例NSCLC中,359例(39.6%)EGFR基因有突变,其中18、19、20、21外显子单独突变分别为6例(0.7%)、152例(16.8%)、8例(0.9%)、170例(18.7%),共见突变类型7种;热点突变类型为19外显子缺失(构成比42.3%)和21外显子L858R突变(构成比45.1%)。女性患者突变率高于男性患者(56.9%vs 25.7%,P<0.05),腺癌患者突变率高于鳞癌患者(49.0%vs 10.0%,P<0.05),未发现EGFR基因突变率与标本来源、年龄和肿瘤细胞比例相关。结论 NSCLC患者EGFR基因突变以19、21外显子突变为主,突变率以腺癌患者和女性较高。

微滴数字PCR和Super-ARMS检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

背景与目的晚期肺腺癌患者在选择靶向药物时需以肿瘤表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突变类型作为依据,然而晚期肺腺癌肿瘤组织取材较难,有专家共识指出外周血可替代肿瘤组织作为检测标本。本文旨在探讨微滴数字聚合酶链反应法(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)和超级扩增阻滞突变系统(super-amplification refractory mutation system, super-ARMS)这两种方法检测晚期肺腺癌患者外周血中血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸(circulating tumor DNA, ctDNA)中EGFR基因突变的临床价值。方法收集2016年2月-2019年2月首都医科大学附属北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌共119例纳入研究,比较ddPCR和Super-ARMS技术检测血浆ctDNA EGFR基因突变的敏感度、特异度。部分EGFR基因经典突变阳性患者接受一线EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)口服治疗,将患者按检测结果分亚组,组1为ddPCR及Super-ARMS检测EGFR基因突变结果均为阳性,21例。组2为ddPCR及Super-ARMS检测EGFR基因突变结果均为阴性,16例。组3为ddPCR检测结果为阳性而Super-ARMS检测结果为阴性,5例。组4为ddPCR检测结果为阴性而Super-ARMS检测结果阳性,因组4患者个数为0,不纳入统计。以客观缓解率(objective response rate, ORR)及疾病控制率(disease control rate, DCR)评估近期疗效,并用生存分析比较组间无进展生存时间(progression-free survival, PFS)以评估远期疗效。结果 119例晚期肺腺癌组织样本中,共检测到58例(48.7%)EGFR基因突变。ddPCR技术检测与肿瘤组织EGFR基因突变结果的符合率为82.4%(Kappa=0.647, P<0.001),灵敏度为74.1%,特异度为90.2%。而Super-ARMS检测与组织检测的符合度为71.4%,灵敏度仅为58.6%,特异度为83.6%。组3的ORR与DCR值低于组1、2,但组间ORR相比均无统计学意义(P>0.05)。生存分析显示,三组患者PFS比较,差异无统计学意义(χ~2=2.221, P=0.329)。结论 ddPCR作为一种高敏感度及特异度的液体基因检测方法,可以作为检测晚期肺腺癌患者血浆ctDNA EGFR基因突变的一种较为可靠的方法。血浆基因检测结果同样可作为EGFR-TKIs药物对患者的疗效预测的依据。

α1,3半乳糖基转移酶基因721C>T突变导致B_w亚型

目的 研究红细胞ABO血型系统Bw亚型的分子基础。方法 通过标准血型血清学方法明确鉴定2个家庭3例Bw亚型,PCR扩增Bw 亚型ABO糖基转移酶基因的增强子、启动子和第1～7外显子及侧翼内含子序列,PCR产物经割胶纯化后直接测序。同时将第6和7外显子克隆到pc DNA3.1(- )质粒,转化DH5α后进行序列分析。采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法证实测序所发现的突变。结果 直接测序发现3例Bw亚型的基因型为B/ O杂合,其中糖基转移酶基因的第2 6 1位G杂合缺失,第72 1位C/ T杂合。克隆证实一条染色体上为正常的O等位基因,另一条染色体上B等位基因(α1,3半乳糖基转移酶基因)存在第72 1位C>T突变,导致多肽链Arg2 4 1Trp替换。序列特异性引物-聚合酶链反应检测14 0份随机样本未发现此突变。结论 α1,3半乳糖基转移酶基因第7外显子72 1C>T突变可能是Bw亚型分子遗传基础之一。

河南省45例未经治疗的艾滋病患者蛋白酶和逆转录酶基因型耐药性检测与系统发生分析

目的了解河南省部分未经抗病毒治疗的艾滋病患者蛋白酶和逆转录酶基因耐药性突变发生的频率、类型和临床意义以及系统发生情况。方法采集河南省45例未经抗病毒治疗的艾滋病患者的抗凝全血,分离血浆,用逆转录聚合酶链反应扩增pol区蛋白酶基因全序列与逆转录酶基因部分序列并直接进行序列测定,提交Web站点http://hivdb.stanford.edu分析耐药性突变。用BioEdit和DNAClub软件以及登陆Web站点http://hivweb.lanl.gov进行系统发生分析。结果从36份血浆标本中扩增出pol区基因并进行了序列测定。蛋白酶基因耐药性主要突变的发生率是8.3%(3/36),突变的类型是D30A、V32A、G73C和V82A;次要突变的发生率是100%,突变的类型为L63PS(36/36)、I93L(35/36)、V77IL(34/36)、A71IVT(10/36)和D60E(2/36)。逆转录酶基因耐药性突变的发生率是38.9%(14/36)。通过对耐药性突变进行评分,并依据此分值解释其临床意义,提示蛋白酶耐药率为5.6%(2/36),逆转录酶耐药率为22.2%(8/36);另有1份标本对全部蛋白酶抑制剂、3份对部分逆转录酶抑制剂潜在低度耐药。系统发生分析显示36份标本的pol区基因与B.US.83.RFACCM17451的亲缘关系最为接近,且彼此之间具有高度同源性,推测此36份标本为同一感染来源,其耐药性突变的发生不是源于耐药株感染,?

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。

非小细胞肺癌患者血浆EGFR基因突变的检测

目的应用探针扩增阻滞突变系统聚合酶链反应(ARMS-PCR)检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆游离DNA中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况。方法收集本院182例非小细胞肺癌晚期患者的外周血,分别提取循环DNA,采用ARMS-PCR扩增EGFR基因的第18、19、20和2l外显子突变,并将部分病例结果与同时期组织或胸水检测结果进行比较分析。结果血浆EGFR基因的突变率为28.0%,主要以19-del突变为主,构成比占56.9%;腺癌患者突变率高于鳞癌患者,差异有统计学意义(32.7%vs.6.7%,P<0.05),未发现血浆EGFR基因突变率与性别、年龄、病理分期和分化程度相关;64例血浆与组织检查结果比对一致率为71.9%,16例血浆与胸水检查结果比对一致率为75.0%,血浆与组织和胸水的检测结果比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论晚期非小细胞肺癌患者血浆EGFR基因的突变率比肿瘤组织和胸水标本低,肿瘤组织仍是最佳的检测标本,实在难以获取肿瘤组织时血浆标本是有效的补充。

3个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的 对 3个肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,AL D) ( MIM# 30 0 10 0 )家系进行基因突变分析。方法 从 3个 AL D患儿及其主要家系成员的外周血白细胞 ,提取总 RNA和基因组 DNA。应用逆转录聚合酶链反应技术 ,对 3个家系的 ABCD1基因编码区 ,分 4个片段进行 PCR扩增并对 PCR产物直接测序。同时应用 PCR-限制性酶切或扩增阻滞突变系统分析相应的基因组 DNA,进一步确证ABCD1基因的突变位点。结果 3名患儿的 ABCD1基因上均存在错义突变 ,其中患儿 1的 ABCD1基因第 5 34位密码子发生 CCC→ CGC改变 ,使脯氨酸被精氨酸取代 ( P5 34R) ;患儿 2的 ABCD1基因第 2 6 6位密码子发生 GGG→AGG改变 ,使甘氨酸被精氨酸取代 ( G2 6 6 R) ;患儿 3母亲的 ABCD1上一个等位基因第 6 17位密码子发生 CGC→ GGC改变 ,使精氨酸被甘氨酸取代 ( R6 17G) ,另一个等位基因未发生突变。结论 在中国人 AL D患者中发现 1个新的 ABCD1基因突变 ( P5 34R) ,并首次在中国人 AL D患者中检测到G2 6 6 R、R6

乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的 利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）基因组C区启动子（basal core promoter,BCP）1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法 根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列（以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列）合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法（金标准）检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果ARMS-PCR法能检测1 × 10^2- 1 × 10^9 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值（驻Ct）在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果（P〈0.05）。结论 建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。

育龄女性叶酸代谢相关酶基因多态性分析

目的对N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的MTHFR C677T基因位点与胱硫醚β合酶(CBS)的CBS T833C、CBS G919A基因位点的基因多态性进行分析,了解其在山西省长治地区育龄女性人群中的分布情况。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对MTHFR C677T进行基因多态性分析;采用扩增阻碍突变系统(ARMS)对CBS T833C、CBS G919A进行基因多态性分析。结果长治地区育龄女性50人中MTHFR C677T基因为CC、CT和TT分别有6,24和20人;C、T等位基因出现的频率分别为36%和64%,纯合突变率为40%;CBS T833C基因为TT、TC和CC分别有6,26和18人;T、C等位基因出现的的频率分别为38%和62%,纯合突变率36%;CBS G919A基因为GG、GA和AA分别有8,30和12人;G、A等位基因出现的频率分别为46%和54%,纯合突变率为24%。结论推测育龄女性人群MTHFR C677T与CBS T833C基因型分布与当地神经管畸形率较高的分布特点相一致。

ARMS-PCR技术在玫瑰果鉴别中的应用

玫瑰果(Rosa canina)是维生素C的重要来源,被广泛用于各种食品和膳食补充剂。刺玫果(Rosa davurica)原产于中国,与玫瑰果属于同一植物属,由于其果实表现出与玫瑰果相似的物理外观和植物化学特征,因此区分玫瑰果和刺玫果具有挑战性。开发一种用于玫瑰果原料鉴定的扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应方法 (ARMSPCR)。与物种特异性PCR相比,试验方法可同时靶向检测玫瑰果及其近亲物种刺玫果。经双盲试验验证该检测方法对玫瑰果的识别概率大于0.9 (95%CI),并证明检测刺玫果的最低检测限为10%。综上所述,该检测方法可用于快速鉴别玫瑰果和刺玫果。

多重ARMS-PCR法检测非小细胞肺癌驱动基因改变

目的采用多重扩增阻滞突变分析系统-聚合酶链式扩增反应(ARMS-PCR)方法检测非小细胞肺癌(NSCLC)常见驱动基因的突变情况,探讨其检测特点及应用优势。方法选取2019-07-15-2021-11-05北京大学第三医院病理科确诊的191例NSCLC,采用多重ARMS-PCR法检测表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)、成神经细胞瘤鼠肉瘤癌基因(NRAS)、编码磷脂酰基醇-3激酶催化亚单位基因(PIK3CA)、鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-Raf)致癌同源体Bl(BRAF)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、RET和c-ros原癌基因1酪氨酸激酶基因(ROS1)驱动基因突变情况,并分析其突变状态与临床病理特征的相关性。结果本组191例NSCLC中有129例(67.54%)检出基因突变,其中肺腺癌基因突变检出率为70.86%(124/175),高于其他类型NSCLC(31.25%,5/16),差异有统计学意义,χ2=10.49,P=0.001。肺腺癌中EGFR基因突变率为52.57%(92/175),KRAS基因突变率为7.43%(13/175);BRAF、HER2和PIK3CA基因突变率分别为1.14%(2/175)、2.29%(4/175)和1.14%(2/175);ALK、ROS1和RET基因融合的发生率分别为5.14%(9/175)、0.57%(1/175)和2.29%(4/175);女性肺腺癌患者EGFR基因突变率(61.46%)高于男性患者(41.77%),χ2=6.736,P=0.009。L858R和19del突变率占所有病例EGFR突变的86.96%(80/92)。结论多重ARMS-PCR技术对NSCLC常见驱动基因突变的检出率与文献报道一致,并具有快速、灵敏度和特异性高等优势,适用于临床短时间内准确获取靶向治疗信息的需求。