应用ARMS- PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变及其临床意义

目的探讨依据ARMS法原理,采用实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的可行性并分析检测的临床意义。方法收集苏州大学附属第三医院2010年9月至2011年12月确诊为NSCLC患者标本64例,DNA提取后,采用ARMS-PCR法对标本进行EGFR基因突变检测并分析EGFR基因突变与患者临床病理参数的关系。结果本研究发现64例NSCLC患者的EGFR总突变率为23.4%,均为19号外显子缺失(19-Del)和21号外显子(L858R)突变;女性EGFR突变率高于男性,腺癌高于鳞状细胞癌。结论 EGFR基因突变检测有助于规范表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在NSCLC患者中的临床应用。

Sanger测序和AMRS-PCR检测ALDH2基因突变结果的比较

目的比较Sanger测序法与扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)在检测患者线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因突变方面的差异。方法将2019年10月至2020年1月于陆军军医大学第一附属医院治疗的350例有冠心病、心肌梗死、心绞痛、原发性高血压病史的患者纳入研究,收集受试者外周血标本。用Sanger测序法与ARMS-PCR法检测ALDH2基因突变,分析两种方法检测结果的差异。结果两种方法检测ALDH2基因突变的总突变率均为33.1%,AA纯合型突变率为3.7%,GA杂合型突变率为29.4%。两种方法检测结果的总符合率为100.00%,突变型阳性符合率和阴性符合率均为100.00%,ARMS-PCR法与Sanger测序法对临床标本的检测结果一致性较好(Kappa≥0.7,P<0.05),具有等效性。另外,ARMS-PCR法检测出的ALDH2基因型分布情况与性别、年龄无关(P>0.05)。结论Sanger测序法和ARMS-PCR法均可准确、有效地检测ALDH2突变情况,但基于成本优势和操作简便的原则,ARMS-PCR法在临床实践中更具优势。

数字油滴PCR法与ARMS法检测结直肠癌BRAF基因突变中应用价值

目的探讨数字油滴聚合酶链式反应法(ddPCR)与扩增阻碍突变系统法(ARMS)在结直肠癌患者丝/苏氨酸特异性激酶基因(BRAF)V600E突变检测中的应用价值。方法收集2018年4月—2019年7月浙江大学医学院杭州市第一人民医院诊治的162例结直肠癌患者的手术标本,采用ARMS法和ddPCR法检测结直肠癌患者BRAF V600E突变,比较ARMS法和ddPCR法检测阳性率及一致性,分析BRAF V600E突变与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果ARMS法和ddPCR法检测BRAF V600E突变阳性率为8.64%(14/162)和9.26%(15/162)。对ARMS法检测BRAF V600E突变存在歧义的1例进行高通量测序,ddPCR法与高通量测序的结果一致。对应ddPCR法,ARMS法的阳性符合率、阴性符合率和一致性分别为93.33%、99.32%和99.38%。年龄越高、组织学类型低分化、临床分期Ⅲ~Ⅳ期患者BRAF V600E突变分布越高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ddPCR与ARMS均可用于检测结直肠癌的BRAF V600E突变,ddPCR有更高的检测效能。

直接测序法与ARMS法检测甲状腺乳头状微小癌组织中BRAF基因突变的比较

目的:探讨直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions amplification refractory mutation system,scorpions ARMS法)检测甲状腺乳头状微小癌组织中(Papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)的鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变的特异性和敏感性。方法:采用直接测序法和ARMS法同时检测56例甲状腺乳头状微小癌患者组织中BRAF基因突变情况。结果:56例患者甲状腺癌组织中,直接测序法与ARMS法所检出BRAF基因突变阳性率分别为32.1%和82.9%,敏感度分别为39.1%和100%,前者均显著低于后者(P<0.01)。结论:检测甲状腺乳头状微小癌组织BRAF基因突变时ARMS方法较直接测序法具有更好的敏感性,癌组织小的标本BRAF基因突变检测更适合用ARMS法。

AMSS-PCR在肺癌突变基因检测中的价值研究

背景与目的肺癌驱动基因检测具有重要意义,目前检测方法多样,临床适用性有差异。本研究旨在比较基于扩增阻碍突变系统-聚合酶链反应(Amplification Refractory Mutation System-polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术的试剂盒与一代测序及ARMS-qPCR检测肺癌突变基因的敏感性和特异性,探究突变位点特异扩增法(Amplification Mutation Specific System, AMSS)-PCR技术在肺癌突变基因检测中的应用价值。方法对前期已行ARMS-PCR检测的肿瘤标本进行一代测序及试剂盒检测,比较各种方法的检测结果,并对检测结果进行统计学分析。结果本研究共收集了309例肺癌标本。试剂盒与一代测序符合率97.41%,ARMS-PCR的符合率97.73%。试剂盒与一代测序、试剂盒与实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)、qPCR与一代测序一致性检验的Kappa值分别为0.946、0.953、0.913。试剂盒以一代测序为参照的受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristiccurve,ROC)曲线下面积为0.976,以qPCR为参照的ROC曲线下面积为0.975。结论 AMSSqPCR技术能够有效检测肺癌突变基因,具有较好的临床应用价值。

数字PCR法和探针扩增阻滞突变法检测非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体突变的比较研究

目的比较数字PCR法和ARMS法检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变的差异,验证数字PCR法的检测性能。方法以ARMS法作为对照参考方法,对36例EGFR突变阳性的NSCLC标本,采用数字PCR法进行EGFR基因突变检测,对结果进行比较研究。结果 ARMS法显示的22例21外显子突变阳性标本中,数字PCR检测全为阳性;ARMS法显示的14例19外显子突变阳性标本中,数字PCR共检出13例19外显子突变阳性。且数字PCR法可以定量检测EGFR突变比率,与临床分期具有相关性。结论数字PCR法与ARMS法的检测一致性较高,可以直接实现绝对定量,对指导患者的个体化治疗具有重要价值。

扩增阻碍突变系统聚合酶链反应同时检测MTHFR和MTRR基因多态性

目的：探讨通过扩增阻碍突变系统聚合酶链反应（ARMS—PCR）方法，在单个PCR反应体系内同时检测MTHFR677C〉T、1298A〉C和MTRR66A〉G基因多态性。方法：选取2012年7月～2013年3月在郑州大学第三附属医院（河南省妇幼保健院）进行孕前或孕期检查的育龄女性135名，留取空腹静脉血通过ARMS—PCR检测MTHFR677C〉T、1298A〉C和MTRR66A〉G基因多态性，同时随机留取30名研究对象口腔黏膜细胞，利用Taqman—MGB技术，通过荧光定量PCR方法验证ARMS—PCR结果。结果：ARMS—PCR产物电泳后条带清晰，易于判读3个位点SNP基因型；荧光定量PCR结果显示，30份样本中，两种方法的基因分型结果完全一致。郑州地区汉族育龄女性中，677T等位基因频率为66．3％，TT纯合子占42．9％；1298C等位基因频率为11．1％，纯合子CC占0．8％；66G等位基因频率为23．3％，纯合子GG占3．0％。结论：ARMS—PCR同时检测MTHFR677C〉T、1298A〉C和MTRR66A〉G基因多态性具有高效、经济、快速的特点，值得在SNP分型中使用。

ARMS实时PCR和MALDI-TOF-MS进行K-ras基因分型

[目的]建立K-ras基因12位密码子第一、二位点基因分型的研究模型。[方法]采用ARMS实时PCR和MALDI-TOF-MS两种方法,以自行构建的质粒DNA为模板,建立K-ras基因12位密码子第一、二位点基因分型的研究模型。[结果]在相同的扩增条件下,采用ARMS实时PCR方法,第一个位点的野生型和突变型的ΔCt值至少为,但第8二个位点野生型和突变型的ΔCt值仅为1～2左右。第二个位点改用MALDI鄄TOF-MS分型方法,采用一条公用引物和dATP,ddTTP,ddCTP和ddGTP的混和物,12密码子第二位点基因分型可以准确检测。[结论]ARMS实时PCR方法分析速度快,操作简便,但它需要合适的反应条件及高质量模板。MALDI-TOF-MS分型方法虽然步骤较多,但准确度高,反应体系稳定并具有高通量潜力。

育龄女性叶酸代谢相关酶基因多态性分析

目的对N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)的MTHFR C677T基因位点与胱硫醚β合酶(CBS)的CBS T833C、CBS G919A基因位点的基因多态性进行分析,了解其在山西省长治地区育龄女性人群中的分布情况。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对MTHFR C677T进行基因多态性分析;采用扩增阻碍突变系统(ARMS)对CBS T833C、CBS G919A进行基因多态性分析。结果长治地区育龄女性50人中MTHFR C677T基因为CC、CT和TT分别有6,24和20人;C、T等位基因出现的频率分别为36%和64%,纯合突变率为40%;CBS T833C基因为TT、TC和CC分别有6,26和18人;T、C等位基因出现的的频率分别为38%和62%,纯合突变率36%;CBS G919A基因为GG、GA和AA分别有8,30和12人;G、A等位基因出现的频率分别为46%和54%,纯合突变率为24%。结论推测育龄女性人群MTHFR C677T与CBS T833C基因型分布与当地神经管畸形率较高的分布特点相一致。

硒蛋白P与布鲁菌感染的关联性

目的:从基因和蛋白水平探讨硒蛋白P(selenoprotein P,Sepp1)与布鲁菌感染的关联性。方法:采用病例-对照研究方法,选择2019年6-9月在包头市九原区和白云鄂博矿区疾病预防控制中心就诊的32例慢性期布鲁菌病(简称布病)患者作为布病组,同时在当地选取30例与布病组有相同流行病学环境的健康人群作为对照组,两组人群均为汉族。采用PCR扩增阻碍突变系统(ARMS-PCR)检测两组人群血液Sepp1基因rs7579位点单核苷酸多态性(SNP),酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆Sepp1蛋白含量。结果:32例布病组患者,女性6例、男性26例,年龄为(50.312±5.035)岁;30例对照组人群,女性4例、男性26例,年龄为(49.994±5.098)岁。两组性别比例、年龄比较,差异均无统计学意义(χ^(2)=0.336,t=1.744,P均>0.05)。布病组和对照组Sepp1基因rs7579位点G、A等位基因和GG、GA、AA基因型总的频率分布比较,差异均无统计学意义(χ^(2)=0.263、0.942,P均>0.05)。分层分析,女性布病组基因型频率(GG:0/6,GA:2/6,AA:4/6)与对照组(GG:4/4,GA:0/4,AA:0/4)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。布病组Sepp1蛋白水平低于对照组(13.71±0.32比19.26±0.69,t=20.316,P<0.05),低Sepp1蛋白水平是布病的危险因素(OR=1.512,95%CI:1.290~1.687)。结论:布鲁菌感染与Sepp1基因rs7579位点SNP有关联,G等位基因可能是女性保护因子;布病还可能与低Sepp1含量有关。