荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值

目的 评价聚合酶链反应 (PCR)荧光探针杂交技术 (TaqMan技术 )检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法 应用细菌学方法(涂片镜检和培养 )及TaqMan法检测 1 3 3份结核病患者痰标本 ,5 3份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为 3 6.1 % ,TaqMan法阳性率为 61 .7% ,高于细菌学检测法 ,经统计学处理 ,两者有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,用TaqMan法检测临床标本特异性为 96.2 %。 结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化 ,在单一管内完成 ,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点 ,是结核病辅助诊断的有效方法之一。

反向线性探针杂交技术检测慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究

目的:建立起简单、快速、灵敏、准确的慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药位点的反向线性探针(reverse lineprobe,RLP)检测方法.方法:根据HBV野生及耐药基因序列设计通用探针、3’、5’对称加有poly-C的特异性探针和5’标记生物素的扩增引物.将探针线性固定在硝酸纤维膜上,使HBV PCR扩增产物与探针进行杂交.通过优化杂交条件,建立RLP检测方法.利用该方法对重庆地区86个慢性乙肝病人进行检测,同时与直接测序结果比较.结果:半巢式PCR可对103拷贝/ml的血清样本进行有效特异扩增,新建的RLP检测方法可对PCR扩增产物在1ng/ml以上,或血清样本中突变型DNA占野生型DNA比例为5%以上的均可有效检测,86例临床的检测灵敏度为100%,野生型和耐药型的检测准确性分别为98.09%(103/105)、100%(43/43),与直接测序法比,RLP检测野生与耐药混合型准确性更好.结论:反向线性探针杂交检测方法检测HBV拉米夫定耐药位点方便、灵敏、准确,是HBV拉米夫定治疗有效的监控工具,该方法适合临床应用.

聚合酶链反应结合探针杂交检测军团菌

利用来源于嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强因子（ｍｉｐ）基因序列的引物，建立了快速检测军团菌的聚合酶链反应技术。扩增反应产物经与地高辛标记的特异寡核苷酸探针杂交证实。用本方法检测接种过军团菌的支气管肺泡灌洗液标本，可检出１００ＣＦＵ／ｍｌ细菌。研究表明它是军团病诊断的一种有效手段。

聚合酶链反应-探针杂交-酶显色用于结核分支杆菌的检测

目的 评价聚合酶链反应 探针杂交 酶显色方法 ,检测结核分支杆菌。方法 收集 131例活动性肺结核患者和 30例非结核呼吸系疾病患者的痰标本以双盲法进行痰涂片抗酸染色检查 ,结核菌培养、PCR 探针杂交 酶显色法、PCR 琼脂糖凝胶电泳技术检查对比。结果 涂片法、培养法、PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性分别为 2 6 72 %、4 1 2 2 %、70 2 3% ,PCR 探针杂交 酶显色法的敏感性显著高于培养法和涂片法 (P <0 0 1)。PCR 探针杂交 酶显色法和PCR琼脂糖凝胶电泳法的敏感性分别为 70 2 3%、70 99% ,特异性分别为 96 6 7%、86 6 7% ,前者特异性比后者高 ,且PCR 探针杂交 酶显色法只检出结核分支杆菌和牛型分支杆菌。结论 PCR 探针杂交 酶显色技术检测结核分支杆菌灵敏度高 ,特异性好 ,简便快速 ,同时能筛检非结核分支杆菌。因此 。

用探针杂交法检测鸡毒支原体和滑液囊支原体

根据鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)的16SrRNA基因序列,设计并合成了探针MG和MS共同目的基因,跨幅为580bp的一对引物。用这对引物对2个标准的MG和1个标准的MS菌株DNA模板进行聚合酶链反应(PCR),结果得到了预期大小约580bp的PCR产物。回收纯化琼脂糖电泳凝胶中的MG扩增产物克隆至T载体中,DIG随机引物法合成核酸探针,斑点杂交试验对MG和MS均呈阳性,检测灵敏度分别为2ng和3ng,其它对照菌(毒)株为阴性。

分子线性探针杂交法在结核分枝杆菌耐药性快速检测中的应用价值

目的探讨分子线性探针杂交法在快速检测结核分枝杆菌耐药性中的效果。方法选择新乡医学院第一附属医院住院治疗的结核患者的临床标本750例,其中结核分枝杆菌临床分离株190例,痰涂片阳性标本560例。所有临床标本分别采用传统方法及分子线性探针杂交法进行检测,对2种方法检测的异烟肼(INH)和利福平(RFP)的耐药结果进行比较,采用分子线性探针杂交法对耐药菌株进行基因分型,分析INH及RFP耐药相关突变位点情况。结果传统方法检测中,560例痰涂片阳性标本中共检测出结核分枝杆菌454例,其对INH、RFP耐药率分别为15.0%(68/454)、17.8%(81/454),190例结核分枝杆菌临床分离株对INH、RFP的耐药率分别为26.8%(51/190)、18.4%(35/190);传统方法检测的结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率分别为18.5%(119/644)、18.0%(116/644)。分子线性探针杂交法检测454例结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率分别为14.1%(64/454)、17.6%(80/454),190例结核分枝杆菌临床分离株对INH、RFP的耐药率分别为23.2%(44/190)、16.3%(31/190);分子线性探针杂交法检测的对INH、RFP的总耐药率分别为16.8%(108/644)、17.2%(111/644)。2种方法检出的结核分枝杆菌对INH、RFP的耐药率比较差异无统计学意义(INH:χ~2=0.140、0.691、0.650;RFP:χ~2=0.011、0.293、0.131;P>0.05)。分子线性探针杂交法检测中,对INH和RFP的灵敏度、特异度分别为85.7%、98.9%和90.5%、98.9%,其中kat G-S315T1为INH耐药主要突变位点,约占88.9%,rpo B-S531L为RFP耐药主要突变位点,约占81.1%。结论分子线性探针杂交法能够快速检测出结核菌株和痰标本中结核分枝杆菌的耐药性,并能对耐药基因进行分型,减少药物敏感性试验的时间,并能根据药物敏感性结果尽快采取有效的治疗方案。

反向线性探针杂交在检测实验动物沙门菌中的研究

目的建立简便、快速、准确、灵敏、特异的沙门菌检测方法。方法根据沙门菌argT基因序列设计通用引物和3'、5'均加有polyC的特异性探针。上游引物5'标记生物素,将探针线性固定在硝酸纤维素膜上,使沙门菌PCR扩增产物与探针进行杂交,通过优化杂交条件,建立反向线性探针杂交检测方法。利用该方法对重庆地区74只实验动物进行检测,同时与传统分离培养方法比较。结果反向线性探针杂交方法灵敏度高,对沙门菌PCR扩增产物在3ng/μL以上可有效检测。从细菌分离培养及DNA提取到PCR扩增及反向杂交结束仅需27h。该检测方法特异性高,对6种非沙门菌的检测中,其特异性为100%。应用传统分离培养方法和反向线性探针杂交方法分别检测42只KM小鼠和32只SD大鼠,两种方法检测结果一致性为100%。结论反向线性探针杂交检测方法,具有快速、可靠、敏感和特异的特点,可用于沙门菌感染时的检测,适合应用于实验动物沙门菌的监测。

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的 建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交 聚合酶链反应 (PCR)方法。方法 利用TaqDNA聚合酶的 5’ 3’核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针 ,导致荧光强度的改变 ,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物。结果 选用 13株常见致病性沙门菌和 7株非沙门菌进行特异性分析 ,所有沙门菌的荧光△RQ值介于 3～ 8之间 ,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于 1;在敏感性分析中 ,采用菌落CFU计数法 ,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含 2 .2 5CFU的沙门菌 ;与传统细菌培养鉴定方法对照 ,对 4 0份各种标本进行沙门菌的检测 ,结果该方法的特异性为 10 0 % ,敏感性为 93.1% ,两种方法的符合率为 95 %。结论 用荧光探针杂交 PCR检测沙门菌 ,是一种快速。

应用特异性核酸探针杂交分析法进行献血员HLA分型的初步报告

目的 探讨利用特异性核酸探针杂交分析法检测HLA等位基因的可行性。方法 10例西南某地献血员 ,提取DNA后经PCR扩增 ,采用酶联探针免疫杂交分析法检测HLAⅠ和HLAⅡ等位基因。结果 10例标本经检测HLAⅠ和HLAⅡ等位基因 ,表现为A 0 2、A 2 4、A 11、B 3 5、B 15、B 5 1、B 5 2、B 40、DRB1 110 1、DRB1 0 90 1、DQB1 0 3 0 3、DQB1 0 3 0 1等类型 ,为常见蒙古人种类型。结论 利用特异性核酸探针杂交分析法可方便快速地对HLA分型 ,值得推广使用。

PCR-荧光探针杂交技术诊断肺结核的价值及卫生经济学评价

目的 探讨PCR -荧光双标记探针杂交定量结核杆菌技术对肺结核的诊断价值并进行卫生经济学评价。方法 对 2 0 0 2年 5月至 2 0 0 2年 11月收治的 30 1例患者进行回顾性研究 ,将痰PCR-荧光探针杂交法与荧光抗酸染色涂片法进行比较 ,以综合临床资料最后确诊为诊断标准 ,计算两种方法的诊断效率及进行成本 -效果分析。结果 痰PCR -荧光探针法诊断肺结核的灵敏度为5 1.9% ,涂片法 1次、3次、6次的灵敏度分别为 4 9.2 %、5 7.4 %、6 1.2 % ,经统计学分析 ,两种方法的检出率比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,进行成本 -效果分析 ,每检出 1例肺结核行 1次痰PCR -荧光探针法患者要花费 2 5 3.4 7元 ,行 1次涂片法要花费 5 0 .17元。结论 PCR -荧光探针杂交法与涂片法比较同样具有快速、有效等优点 ,但经济效率低于荧光涂片法 ,目前尚不能取代后者在诊断结核病中的传统地位。

用PCR和探针杂交法检测鸡败血霉形体

根据鸡败血霉形体 f MG-2核酸片断序列 ,设计合成了 1对 2 5bp寡核苷酸引物 ,对鸡败血霉形体基因组 DNA进行扩增 ,均获得预期的 73 2 bp扩增产物 ,检测灵敏度为 1 pg;参考菌株 DNA无扩增。回收纯化琼脂糖电泳凝胶中的扩增产物 ,DIG随机引物法合成核酸探针 ,Dot-blot杂交试验 ,鸡败血霉形体呈阳性 ,检测灵敏度为 1 0 0 pg;其他为阴性。对自然发病鸡群检测进一步表明 ,建立的 PCR和探针杂交法具有高度的灵敏性和特异性 。

聚合酶链反应结合DNA探针杂交在结核杆菌检测中的应用

应用PCR和Southern转移、光敏生物素标记DNA探针杂交技术进行了结核杆菌检测的应用研究。实验结果表明PCR结合探针杂交可将PCR敏感性提高100倍,但不影响其特异性。106例结核性痰标本PCR检测阳性率为46.2％,结合探针杂交达76.4％,涂片阴性的标本差异尤为明显,因而显著提高了结核阳性诊断变率。21例非结核性痰标本PCR和探针杂交未发现假阳性。对临床可疑而PCR阴性标本有必要合用DNA探针杂交。

PCR和探针杂交法联合检测鼻咽癌组织中的EB病毒

ＰＣＲ和探针杂交法联合检测鼻咽癌组织中的ＥＢ病毒张捷ＪｏｅＭａａ（北京医科大学第三医院检验科１０００８３美国加州旧金山州立大学）近年来有许多检测ＥＢＶ的血清学方法，但对高分化型鼻咽癌（ＮＰＣ）的检出率比较低；本文使用灵敏性较好的ＰＣＲ技术和探针杂交的...

应用线性探针杂交技术快速检测结核分枝杆菌的多药耐药性

目的:评价线性探针杂交技术(HAIN技术,Geno Type MTBDR plus试剂盒)快速检测结核分枝杆菌多药耐药性的价值。方法:利用HAIN技术检测277例涂阳患者痰标本,并与比例法药敏试验作比较。结果:HAIN技术对肺结核患者耐多药的检出率和传统比例法药敏试验相比无显著差异(P>0.05)。HAIN技术检测耐利福平、耐异烟肼和耐多药结核的灵敏度、特异性分别为100%、81.69%、80.77%和100%、93.90%、95.74%。利福平耐药基因突变频率最高的是rpo B S531L位点[35/60(58.33%)];异烟肼耐药基因最常见的突变是kat G S315 T1位点[42/71(59.15%)],其次是inh A c15t位点[23/71(32.39%)]。结论:HAIN技术能快速、准确诊断结核分枝杆菌利福平、异烟肼的耐药性及多药耐药性。

DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较

目的建立和优化扩增慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因的PCR方法,比较DNA测序法与线性反向探针杂交法检测HBV基因突变情况,并对耐药相关基因突变及其意义进行分析。方法采用巢式PCR法扩增93例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因反转录酶区,对PCR产物进行DNA测序,采用Bioedit6.0.5、SeqmanTMⅡ、EditSeq TM和Me-gAlign软件分析结果;同时随机抽取40份血清进行线性反向探针杂交,比较两者的检测结果,并对11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在93份标本中DNA序列测定法检测到碱基突变113个,其中与LAM相关突变50份(53.78%),与ADV相关突变6份(6.46%),与LdT相关突变3份(3.23%),与ETV相关突变3份(3.23%);在40份血清中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为87.5%(35/40),氨基酸位点一致为98.0%(431/440)。此外,还检测到V84I、S85C、A181S、L229W、N238T等与耐药相关的突变位点。结论应用线性反向探针杂交检测虽然比较快捷,但其价格昂贵且只能检测已知常见的变异位点;建立在巢式PCR基础上的DNA序列测定法敏感性与线性反向探针杂交法相当,两者检测结果有较高的符合率,但似可检出更多的耐药相关突变。

分子线性探针杂交方法用于耐多药结核病耐药性分析的应用研究

目的评价分子线性探针杂交方法(LPA)在快速检测耐多药结核病人耐药性的应用价值。方法利用分子线性探针杂交方法检测415例结核分枝杆菌临床分离株,同时使用常规药敏方法对样本进行抗结核药物敏感性测试。结果线性探针杂交法检测415例结核分枝杆菌临床分离株RFP和INH耐药性的灵敏度、特异性分别为91.43%、94.20%和75.68%、95.89%,两种检测方法的kappa值分别为0.830、0.731;线性探针杂交法检出MDR的敏感度和特异度分别为75.44%、95.25%,两种检测方法的kappa值为0.692。线性探针杂交法检测的耐药株中RFP常见的突变型主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)。结论线性探针杂交法在结核病耐药分析中能够快速、准确的鉴定出RFP和INH的耐药性以及常见耐药基因型,能够大幅缩短药敏试验时间,便于及时用药治疗,对控制耐药结核病的传播有重要意义。

酶连接探针杂交芯片特异性检测转基因水稻品系

酶连接探针杂交芯片是一种基于连接酶催化的探针杂交芯片技术,其原理是采用硫代引物保护法,利用Lambda DNA外切酶将多重聚合酶链式反应产物切割成单链。在氨基修饰的芯片上固定5’端探针,并与制备的产物单链进行杂交,加入荧光修饰的第2个探针与之前的探针进行酶连接反应,从而实现高特异性、高通量检测。结果表明:酶连接探针杂交芯片技术检测4种转基因水稻品系特异性好,灵敏度可达0.1%(m/m),可以应用于进出口检验检疫、食品安全监测等领域。

用^(32)P-ALU 探针杂交法对DNA键断裂的定量分析

电离辐射引起的 DNA 损伤包括碱基破坏和消除、糖损伤、单键断裂,双键断裂,DNA-蛋白质交联及碱不稳定位点(alkli-labile site)等几种类型。对这些损伤进行测定、估算的方法有:DNA 沉淀、中性抽提、碱性抽提、荧光测定分析、碱解键和放射免疫分析,其中多数分析的原理是基于在一定的辐射剂量下形成单键 DNA 量的能力,

影响RNA芯片探针杂交效率的因素分析

RNA芯片作为研究ncRNA的主要技术之一,已受到广泛关注。然而因RNA芯片中靶序列的单链特征,使得RNA芯片的探针设计比DNA复杂。本研究对加强型绿色荧光蛋白(EGFP)RNA序列进行覆瓦式探针设计,制作了RNA原位合成芯片,研究探针/靶序列杂交双链ΔG和Tm、靶序列二级结构以及探针的末端碱基对RNA芯片杂交信号强度的影响。结果表明,探针/靶序列杂交双链ΔG和Tm相同的探针间的杂交信号存在较大差异,探针/靶序列杂交双链ΔG和Tm与RNA芯片杂交信号之间未发现明显的规律性;靶序列二级结构的探针PT-sc参数与芯片杂交信号强度间呈较好的线性关系;探针5’末端碱基组成对芯片杂交信号强度也有影响,5’末端碱基为G/C的探针杂交信号总体上高于其邻近的5’末端碱基为A/T的探针的杂交信号,为RNA芯片的探针筛选提供一定的理论基础。