基于高分辨率熔解曲线分析技术探讨TNF-α基因多态性与银屑病的相关性

目的:运用高分辨率熔解曲线(HRM)分析技术分析TNF-α基因rs3093662位点的多态性与银屑病的相关性。方法:应用荧光定量PCR-HRM分析技术对我院收治的426例银屑病患者(研究组)和485例健康人(对照组)的TNF-α基因位点rs3093662的基因型及等位基因进行测定。结果:rs3093662的AG、AA、GG基因型频率在银屑病研究组和对照组分别是7.98%、92.02%、0.00%和4.54%、95.46%、0.00%,A、G等位基因频率在银屑病研究组和对照组分别是96.01%、3.99%和97.73%、2.27%,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TNF-αrs3093662的基因多态性可能与银屑病的发病相关,HRM分析技术检测基因多态性具有操作简单,敏感性高,成本低,适合在临床检测中推广应用。

多色探针熔解曲线分析法评估结核分枝杆菌阳性患者对不同抗结核药物耐药性的诊断效能

目的:分析多色探针熔解曲线分析法(MMCA)评估结核分枝杆菌阳性患者对利福平、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼、喹诺酮耐药性的诊断效能。方法:选取2023年1—6月泉州市各县(市)区结核定点医院收治的100例结核分枝杆菌阳性患者的痰培养标本,经过培养与分离获取100例结核分枝杆菌株,以改良罗氏比例法药敏试验为金标准,通过MMCA检测结核分枝杆菌对利福平、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼、喹诺酮的耐药性,记录其符合率、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果:MMCA检测利福平耐药性的符合率为94.00%,敏感度为83.33%,特异度为95.45%,阳性预测值为71.42%,阴性预测值为97.67%。MMCA检测乙胺丁醇耐药性的符合率为97.00%,敏感度为87.50%,特异度为97.83%,阳性预测值为77.78%,阴性预测值为98.90%。MMCA检测链霉素耐药性的符合率为98.00%,敏感度为85.71%,特异度为98.92%,阳性预测值为85.71%,阴性预测值为98.92%。MMCA检测异烟肼耐药性的符合率为90.00%,敏感度为76.47%,特异度为92.77%,阳性预测值为68.42%,阴性预测值为95.06%。MMCA检测喹诺酮耐药性的符合率为94.00%,敏感度为81.82%,特异度为95.51%,阳性预测值为69.23%,阴性预测值为97.70%。结论:MMCA评价结核分枝杆菌对利福平、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼、喹诺酮的耐药性具有较好的特异度与敏感度,且便于检测,有助于对耐药结核杆菌的快速筛查。

基于MLPA结合熔解曲线法鉴别山药及其常见混伪品

目的:利用MLPA技术结合熔解曲线法建立一种能鉴别山药及其常见混伪品的新方法。方法:以山药、参薯、木薯、番薯为研究对象,针对四个物种的matK序列分别设计MLPA特异性探针,通过DNA变性、杂交、连接、扩增及熔解反应等步骤,建立MLPA-熔解曲线鉴别体系,利用各样品熔解曲线中特异性峰(Tm值)的差异实现不同物种的鉴定。结果:27份样品中,山药Tm值为78.3℃,参薯Tm值为79.9℃,木薯Tm值为81.2℃,番薯Tm值为82.9℃,且相互之间没有交叉干扰。该法对山药、参薯、木薯、番薯各自单独的最低检测限为0.1 ng/μL;对相互混淆掺伪的最低有效检出率为5%。27份样品的检测结果均与测序结果一致。结论:MLPA技术结合熔解曲线法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,具有进一步推广应用的潜力。

基于单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析方法定量检测HBeAg阳性患者前C区变异株

目的建立一种HBV复杂前C区变异株精确定量的检测系统。方法分两步实时PCR完成检测。首先应用野生株阻断探针(WT-blocker probe)进行选择性抑制野生株病毒的扩增,而含量偏低的变异株病毒得以扩增约10000倍,使其在后续反应中易于检出;第二步应用单标记探针(Simple Probe)结合熔解曲线分析系统精确定量检测前C区G1896A、G1899A、G1896A/G1899A变异株。通过PBPPO(primer-blocker-probe partial-overlap)设计减少基因多态性对检测的影响,来提高检测精确度。检验结果经直接测序及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法予以证实。结果 4种标准质粒(G1896/G1899、G1896A、G1899A、G1896A/G1899A)能够很好地被检出并予以区分,突变检测灵敏度达到0.01%;10例HBeAg阳性(直接测序法鉴定前C区变异阴性)患者血清标本中,每例至少1种前C区变异株被检出。结论单标记探针实时荧光定量PCR和熔解曲线分析能够早期灵敏检测前C区变异株,前C区变异株进化过程及机制还需进一步大样本、纵向队列研究予以阐明。

高分辨率熔解曲线分析技术检测BRAF基因V600E突变方法的建立及初步临床应用

目的建立高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测BRAF基因V600E突变的方法,并探讨其在临床检测中的应用价值。方法用所建方法检测16例甲状腺乳头状癌患者超声引导下细针穿刺抽吸活检标本,并与测序法结果进行比较分析。结果所建HRM检测方法 Ct值与Tm的CV值均较小,重复性好。HRM法BRAF基因V600E突变检测标本的结果与测序法相比较,突变检出率分别为43.75%和40.00%,敏感性为100.00%,特异性为90.00%。结论成功建立的HRM法检测BRAF基因V600E突变敏感性高,特异性强,重复性好,操作简便,节约时间,成本低,适合细针穿刺抽吸活检标本检测BRAF基因V600E突变。

高分辨率熔解曲线分析技术检测血清游离DNA的EGFR基因突变

目的利用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting,HRM)检测石蜡包埋组织和血清游离DNA的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,分析两者之间的关系,并探讨其临床应用价值。方法利用HRM技术检测EGFR基因突变的方法,检测200例非小细胞肺癌患者石蜡包埋标本和200例相应的血清游离DNA,并将二者结果进行比较分析。结果HRM法检测非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变总检出率为43.5%,血清游离DNA的EGFR基因突变总检出率为25.0%,HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变与检测石蜡包埋组织DNA的EGFR基因突变相比,敏感性为57.5%,特异性为100%。结论 HRM法检测血清游离DNA的EGFR基因突变为无法获取肿瘤组织标本的患者提供了新的检测机会。

应用多色探针熔解曲线分析法检测湘潭地区G6PD缺乏症基因突变

目的探讨多色探针熔解曲线分析(MMCA)法检测湘潭地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症基因突变的性能,为临床诊断提供参考。方法纳入2017年1月至2020年9月于该院进行G6PD缺乏症筛查的90221例新生儿,以其中454例同时进行G6PD酶活性法检测和基因检测[MMCA法、外显子基因测序(Sanger测序)法]的G6PD缺乏症初筛阳性新生儿作为研究对象,以Sanger测序法的检测结果为“金标准”,对酶活性法和MMCA法进行方法学比较。结果酶活性法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为97.6%,特异度为100.0%;诊断女性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为59.5%,特异度为100.0%。酶活性法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性较好(Kappa=0.974,P<0.05),诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性一般(Kappa=0.676,P<0.05)。MMCA法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度为97.0%,特异度为100.0%;诊断女性新生儿G6PD缺乏症的灵敏度、特异度均为100.0%。MMCA法与Sanger测序法诊断男性新生儿G6PD缺乏症的结果一致性较好(Kappa=0.967,P<0.05),诊断女性新生儿G6PD缺乏症的结果完全吻合(Kappa=1.000,P<0.05)。结论与传统的酶活性法比较,MMCA法具有灵敏度、特异度高的优点,是一种快速、准确、适用于临床诊断G6PD缺乏症的方法。

高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展

高分辨熔解曲线分析技术(HRM)是在2002年由Utah大学Wittwer实验室和Idaho公司合作研发,它的原理是在PCR基础上加入饱和荧光染料、监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技术[1]。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的各个领域,对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。

高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术

目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等。

应用高分辨率熔解曲线分析技术快速产前诊断致死性骨发育不良Ⅰ型2例报告

致死性骨发育不良(Thanatophoric dysplasia,TD)是常见的致死性骨骼发育不良疾病,属常染色体显性遗传病,发生率约为活产的(0.21~0.30)/10000[1]。主要表现为严重短肢、短指/趾、头大、前额突出、鼻梁塌陷、胸廓狭窄、小肋、腹膨隆。

应用多色探针熔解曲线法检测G6PD缺乏症杂合子的基因突变

目的应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症杂合子的临床方法。方法收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例)疑似G6PD缺乏症的患者外周血,采用G6PD/6PGD定量比值法和MMCA法分别检测男性和女性G6PD酶活性和基因突变,以金标准Sanger测序来评价两种方法。同时收集重庆地区进行G6PD缺乏症新生儿疾病筛查的1 754份女性末梢血滤纸片,采用MMCA法筛查G6PD基因突变。结果 429例疑似病例中,G6PD/6PGD定量比值法诊断男性的灵敏度96.8%、特异性100%,与Sanger测序法一致性好(Kappa=0.917,P<0.05);但女性的灵敏度仅10%,特异性100%,与Sanger测序法一致性差(Kappa=0.127,P<0.05)。MMCA法诊断男性的灵敏度95.7%,特异性100%,与Sanger测序法一致性较好(Kappa=0.891,P<0.05);女性的灵敏度100%,特异性100%,与Sanger测序法结果完全吻合(Kappa=1.000,P<0.05)。1 754例女性中杂合子占1.14%(20/1 754),G6PD酶活性均正常。结论与传统的G6PD/6PGD定量比值法比较,MMCA法检测杂合子灵敏度更高,可用于G6PD缺乏症杂合子筛查,为一种简便、准确的诊断新方法。

多重连接探针扩增结合熔解曲线法鉴别南、北板蓝根掺杂

目的 针对南、北板蓝根在市场流通和中医临床用药中混用现象,建立多重连接探针扩增结合熔解曲线法来快速准确地鉴别两者。方法 针对南、北板蓝根ITS2序列设计两对特异性探针,通过DNA变性、杂交、连接、扩增和进行熔解程序建立MLPA-熔解曲线,根据T_(m)值的差异进行鉴别,并对其探针特异性和检测灵敏度进行考察。结果 在特异性试验中,南板蓝根产生84.98℃的熔解曲线峰,北板蓝根产生83.35℃的熔解曲线峰;在灵敏度试验中,南板蓝根中掺杂10%的北板蓝根或北板蓝根中掺杂5%的南板蓝根均可被检出。26批商品药材中,有12批熔解曲线峰与北板蓝根相符,14批熔解曲线峰与南板蓝根吻合,与测序结果一致。结论 该方法灵敏准确,特异性强,可为南、北板蓝根的鉴别提供支持。

多重连接探针扩增-高分辨熔解法鉴别鸡血藤及其常见混伪品

目的采用分子生物学技术鉴别鸡血藤及其常见3种混伪品。方法根据4个物种核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列差异设计特异性探针,结合运用多重连接探针扩增(MLPA)技术与高分辨熔解(HRM)曲线技术,根据特异性探针熔解温度(T m)差异鉴别鸡血藤及其常见混伪品大血藤、白花油麻藤、香花鸡血藤。结果4个物种特异性探针T m值分别为:鸡血藤(87.0±0.2)℃、大血藤(82.8±0.2)℃、白花油麻藤(85.4±0.2)℃、香花鸡血藤(80.1±0.2)℃。探针特异性考察中,交叉反应与空白组均未产生熔解峰,表明探针具有良好特异性。构建的方法可用于1.0 ng模板DNA的检测,并可有效检出鸡血藤中掺混5%大血藤、白花油麻藤或香花鸡血藤。结论基于MLPA-HRM技术建立的鸡血藤及其混伪品鉴别方法灵敏度高,特异性强,稳定性好,可有效解决市场上鸡血藤药材植物来源复杂、混伪品难以鉴别的问题。

115462例新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查及基因突变分析

目的了解贵阳地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)缺乏症发病情况和基因突变特点,为贵阳地区G6PD缺乏症的防治提供科学参考。方法募集该地区2020年8月至2023年1月出生的新生儿,应用荧光分析法对其血斑样本进行G6PD酶活性筛查,召回初筛阳性儿,完成G6PD酶活性诊断及多色探针荧光PCR熔解曲线法(Multicolor probe melting curve analysis method,MMCA)基因突变分析。结果共募集115462例新生儿,G6PD酶活性筛查血斑样本共筛出阳性1606例,筛查阳性率为1.39%(1606/115462),其中男性为1.83%(1130/61801)、女性0.89%(476/53661),男女新生儿G6PD酶活性初筛阳性率差异有统计学意义(P<0.01);召回初筛阳性患儿,G6PD基因突变检出率87.07%(909/1044),其中男性为90.09%(764/848),女性为73.98%(145/196),男女间G6PD基因突变检出率差异有统计学意义(P<0.01)。本研究共检出13种类型G6PD基因单一突变型(c.1024 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.1376 G>T、c.592C>T、c.871 G>A、c.519 C>T、c.392G>T、c.493 A>G、c.1004C>A、c.1360C>T、c.383T>C、c.517T>C)和6种复合突变型(c.1376 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 G>T杂合复合c.95A>G杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.1388 G>A杂合突变、c.1024 C>T杂合复合c.519C>T杂合突变、c.1376 G>T杂合复合c.1024 C>T杂合突变、c.95A>G杂合复合c.1388 G>A杂合突变)。贵阳地区G6PD缺乏症基因突变类型复杂多样,G6PD突变常见类型为c.1024 C>T、c.1388G>A、c.95 A>G、c.1376G>T这四种类型。结论贵阳地区G6PD基因突变位点具有明显地域性特征,开展G6PD酶活性筛查及相关诊断检测,有利于本地区G6PD缺乏症的筛查、确诊、治疗和防控,有效提高出生人口素质。

利用多重连接探针扩增结合熔解曲线法鉴别五味子与南五味子掺杂

目的探究多重连接探针扩增技术(MLPA)结合熔解曲线在五味子和南五味子鉴别中的应用。方法以五味子和南五味子为研究对象,基于其ITS2序列设计探针进行MLPA反应,通过分析荧光熔解曲线的Tm值对二者进行鉴别,并将此方法应用到市场随机收集的31份五味子和南五味子商品中,通过对聚合酶链反应(PCR)产物测序验证此方法的准确性。结果两对探针都表现出很好的特异性和灵敏度,均只出现对应的单一熔解曲线峰,五味子产生82.3℃的熔解曲线峰,南五味子产生80.7℃的熔解曲线峰。31份五味子商品中,16份商品的熔解曲线Tm值与五味子吻合,15份商品的熔解曲线Tm值与南五味子吻合,实验结果与测序结果一致。结论该研究建立的方法特异性强,灵敏度高,且操作简单方便,可以快速鉴别五味子及其掺混品。

FMCA技术分析大前庭水管综合征家系及产前诊断

目的应用FMCA技术检测双侧前庭水管扩大家系SLC26A4基因,探讨前庭水管扩大与SLC26A4基因的关系及FMCA技术最优条件。方法收集EVA家系临床资料,基于荧光定量PCR熔解曲线平台,运用FMCA技术分析107例正常人,6个EVA家系19位成员的SLC26A4基因IVS7-2A>G(919-2A>G),2168A>G及1229C>T突变位点。并用直接测序技术予以验证。结果 107例正常人中有2例SLC26A4基因杂合突变,突变率为1.87%;EVA家系中有3例SLC26A4基因纯合突变,3例SLC26A4基因复合杂合突变,10例SLC26A4基因杂合突变,3例无SLC26A4基因突变,SLC26A4基因突变率为84.21%。对家系a进行产前诊断,结果为IVS7-2A>G/1229C>T复合杂合突变。所有检测结果与测序结果一致,符合率为100%。结论 FMCA平台能快速检测SLC26A4基因的IVS7-2A>G,2168A>G与1229C>T突变,其操作简单,成本低。且经测序技术验证,结果准确。可作为诊断遗传性疾病及产前诊断的快速有效方法。

多色探针熔解曲线分析法对5种抗结核药物的耐药性诊断价值

目的探讨多色探针熔解曲线分析法(multicolor melting curve analysis,MMCA)对5种抗结核药物的耐药性诊断效果,明确MMCA检测结核分枝杆菌耐药性的临床应用价值。方法2021年4月—2022年5月选择在本院住院诊治的结核分枝杆菌阳性患者200例作为研究对象,取患者的痰液标本,分别给予传统结核分枝杆菌药敏实验(改良罗氏培养基法)和MMCA检测利福平、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼、左氧氟沙星等5种抗结核药物的耐药性,对两种诊断方法结果不一致的样本进行基因测序验证,对比MMCA对5种抗结核药物的诊断效能。结果以结核分枝杆菌改良罗氏培养基法作为耐药诊断的金标准,MMCA检测利福平、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼、左氧氟沙星耐药的灵敏度分别为95.83%(46/48)、93.75%(15/16)、100.00%(15/15)、100.00%(20/20)、70.00%(7/10),组间比较具有统计学差异(P<0.05),MMCA检测5种抗结核药物的特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。对MMCA与改良罗氏培养基法结果8例不一致的样本进行基因测序,与基因测序结果进行比较后发现,MMCA与基因测序结果符合率为75.00%(6/8)。结论MMCA在结核病患者耐药突变的检测中,对一线抗结核药物具有很高的诊断效能,对于二线抗结核药物左氧氟沙星的敏感度不足,因此在一线抗结核药物的检测上,MMCA技术具有良好的临床应用前景。

高分辨熔解曲线分析技术检测α-地中海贫血常见三种点突变

α-地中海贫血（简称α-地贫）是由于α珠蛋白基因缺失（缺失型）或点突变（非缺失型）导致α珠蛋白肽链合成减少或完全不合成而引起的一种溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传。

HRM-非标记探针法检测IL-15基因SNPs方法的建立

目的建立用于检测白细胞介素-15(IL-15)基因单核苷酸多态性(SNP)位点的高分辨率熔解曲线(HRM)-非标记探针的方法。方法采用HRM-非标记探针法及小片段扩增法对80名健康儿童IL-15基因4个SNPs位点进行基因分型,采用基因测序法进行验证并同时与小片段扩增法分型结果进行比较。结果 HRM-非标记探针法与基因测序分型结果一致,准确率为100%;未加入温度内标的小片段扩增法不能区分野生纯合子和突变纯和子。结论 HRM-非标记探针法是对已知SNP位点突变研究的一种廉价、简便、准确的基因分型技术,适合于对已知的SNP位点或基因突变进行分型和检测。

137例上海地区出生新生儿家系G6PD基因突变分析

目的了解上海地区出生的新生儿及其家系葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症基因突变特点,探讨该病的发病机制,提高诊断水平。方法用高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术对中国人常见的突变类型G1388A、G1376T、A95G、G392T、G871A、C1311T、C1024T、C406T进行分析鉴定。结果 137例新生儿的家系中258例患者有213例检出突变类型,45例未检出突变类型。单个位点突变184例,G1376T,66例(30.9%);G1388A,64例(30%);A95G,25例(11.7%);C1024T,16例(7.5%);G392T,10例(4.7%);C406T,3例(1.4%)。复合位点突变共29例,G871A+C1311T+IVS11 93T→C,10例(4.7%);G1376T+IVS11 93T→C,7例(3.3%);C1311T+IVS11 93T→C,5例(2.3%);C406T+C1311T,2例(0.9%);G1388A+IVS11 93T→C,2例(0.9%);G1376T+C1311T+IVS11 93T→C,1例(0.5%);A95G+C1311T+IVS11 93T→C,1例(0.5%);C1024T+IVS11 93T→C,1例(0.5%)。结论随着外来人口的流入和通婚的增多,上海地区的G6PD基因突变也在发生变化,基因诊断是对该病分子水平的诊断,有利于杂合子的检测,以便做好产前筛查,同时对研究人口迁徙与遗传病分布之间的关系有一定意义。