猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

牛传染性鼻气管炎gB基因TaqMan探针及SYBR Green 1荧光定量PCR方法的建立与比较

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)荧光定量PCR检测方法,本研究利用IBRV g B基因序列设计引物及相应探针,分别建立Taq Man探针与SYBR Green 1荧光定量PCR方法,并对两种方法的敏感性等综合比较。结果显示,SYBR Green 1荧光定量PCR方法的相关系数(R2)为0.998,扩增效率(E)为95.7%;Taq Man探针荧光定量PCR方法的R2为0.999,E为108.3%;两种方法的敏感性均为0.2 TCID50,变异系数均小于3%。综合结果显示,两种检测方法无显著差异。最后,本研究成功建立了检测IBRV的荧光定量PCR,将为IBRV的临床检测提供方法。

基于TaqMan-MGB探针荧光定量PCR技术检定细菌和人基因组拷贝数比值方法的建立

目的建立一种可以检测细菌和人基因组拷贝数比值的方法。方法分别设计细菌和人基因组特异性引物及通用探针。以大肠埃希菌和幽门螺杆菌混合菌液及人全血样本模拟混合样本。采用TaqMan-MGB荧光PCR方法对不同稀释浓度的混合样本进行定量分析。通过比较实测比值(Ct值换算成拷贝数的比值)与理论比值,评估本研究方法的可行性和准确性。结果经变异系数法(CV)分析,6个不同浓度样本(DB1、DB2、DB3、DH1、DH2和DH3)的CV值依次为4.48%、1.57%、4.67%、1.55%、0.49%和1.29%。9组模拟混合样本中,实测比值(DB/DH拷贝数)和理论比值的误差均小于0.1,且两组数值相关性极显著(r=1.000,P<0.001)。结论本研究建立的基于TaqManMGB探针荧光定量PCR技术检定细菌和人基因组拷贝数比值的方法重复性和准确度良好,可用于细菌和人类组织样本基因组拷贝数比例的检定。

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。

非洲猪瘟病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因核苷酸序列设计特异性引物和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)-TaqMan探针,建立了基于P72基因的LNA-TaqMan探针的ASFV荧光定量PCR方法。结果显示,所建立的LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度,最低检测限为3.9拷贝/μL,且与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应;该方法的重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%;56份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本试验所建立的ASFV LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法敏感性、特异性和重复性良好,为ASFV检测提供了一种新的技术选择。

荧光探针定量PCR技术

PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增,实现目的基因的检测.荧光探针定量PCR(FQ-PCR)是一种新的基因定量检测技术,国外文献多用"实时定量PCR(real time quantitative PCR)"或"TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名)".该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,巧妙地把核酸扩增(PCR)、杂交及光谱技术结合在一起,从而实现了对目的基因的准确定量检测,正发展成为临床实验诊断的常规技术.

荧光探针定量PCR及其临床应用

荧光探针定量PCR (FQ—PCR)由PCR与荧光素标记的探针杂交技术相结合,可用来检测临床标本中各种病原微生物的RNA/DNA。具有快速、简便、敏感、特异之优点。因其在单一试管内进行PCR扩增,可避免普通PCR由于污染所造成的假阳性,并可定量检测各种病原微生物的RNA/DNA含量。

实时荧光探针定量PCR在小儿沙眼衣原体肺炎诊断中的临床应用研究

目的观察荧光定量PCR在小儿沙眼衣原体肺炎诊断中的应用价值及探讨不同年龄阶段小儿沙眼衣原体（CT）肺炎的临床特点。方法将我院2004年1～12月份收治60例小儿CT肺炎做研究对象，根据年龄分组，对各组患儿均通过咽拭子或吸痰法获取标本，进行CT～DNA定量分析；回顾性总结分析60例CT肺炎。结果60例标本中，10^6拷贝数5例，10^5拷贝数6例，10^4拷贝数10例，10^3拷贝数39例；小婴儿CT肺炎往往无发热性肺炎，易合并细菌感染：3岁以上儿童则易出现发热、肺部体征大多阴性，而X线多表现为节段性肺炎，其临床经过类似支原体肺炎。结论1．实时荧光定量PCR检测CT～DNA是诊断小儿沙眼衣原体肺炎最直接、最客观的指标。2．CT肺炎在不同年龄阶段的临床表现存在显著差异。

牛冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立特异灵敏的牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)荧光定量PCR检测方法,并对牛源性样本进行筛查。方法根据Genbank中登录的BCV的N基因序列设计Taq Man引物探针,建立基于Taq Man探针法的BCV PCR检测方法,对收集到的牛源样本进行BCV筛查,并对部分阳性样本的PCR产物进行测序鉴定。结果建立了能够特异检测BCV的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,其标准曲线相关系数Slope为-3.417,相关系数r2为0.999,,扩增效率Eff为96.195%。该方法检测BCV的敏感度为40 copies。使用该方法检测64份牛肛拭子样本检出率为1.5%,检测33份牛源生物制品检出率为6%,部分阳性样本的PCR产物经测序比对为BCV核酸序列,说明BCV在国内牛群中流行,牛源相关生物制品中有感染BCV的潜在风险。结论经测序验证,建立的方法能够灵敏的检测样本中的BCV核酸,应加强牛源相关生物制品中BCV的监测,避免人感染BCV的潜在风险。

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的:建立双重荧光定量RT-PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒,并应用于临床样本的检测。方法:在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化单一和双重荧光RT-PCR反应体系,评价所建双重RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果:该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性,检出限分别为0.1TCID50和0.01TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0.998和0.999,具有较好的稳定性。结论:本研究建立的双重荧光定量RT-PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测流感病毒的新方法。

RHCE~* ce(308C>T)突变型等位基因Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立Rh血型系统RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法,筛查携带该等位基因的个体,并对其Rh CE血型抗原进行鉴定分析。方法针对RHCE基因c. 308C〉T突变位点设计特异性引物及Taqman-MGB探针,采用已知携带该突变位点的标本作为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法。应用该方法对800例RhD阴性标本、1 000例RhD阳性标本以及400例D放散型标本进行突变筛查,同时随机抽取200例标本进行RHCE基因外显子2直接测序。对筛查出携带该突变型等位基因的标本进行RHCE基因外显子2测序确证,同时应用多重连接依赖式探针扩增（MLPA）基因检测结合测序方法对其进行Rh血型基因型鉴定,并进行Rh血型血清学检测。此外,采用6种针对不同抗原表位的单克隆抗体对Rhc抗原的表达进行血清学鉴定,并采用4种抗-c进行Rhc抗原的流式细胞检测。结果成功建立RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR方法。应用该方法从800例RhD阴性标本中筛查出2例携带该突变型等位基因标本,RHCE基因外显子2测序结果证实存在杂合点突变（c. 308C〉T,p. 103Pro〉Leu）,但在RhD阳性及D放散型标本中未检出此突变。此2例标本的Rh抗原表型均为CCdee,基因型均为Cde/c^vde[c^v表示RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因]。该2例标本的Rhc抗原血清学和流式细胞检测均为阴性,而Rh C抗原表达正常。结论 Taqman探针实时定量PCR方法进行RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因检测快速准确,该等位基因可导致c抗原不表达。

BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒与猪圆环病毒2型双重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,研究根据Gen Bank中已登录的PRRSV-M基因序列和PCV2cap基因序列,设计了2对特异性引物和2条Taq Man探针。结果显示以含有PRRSV-M基因和PCV2-cap基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R^(2))均大于0.99,线性关系较好。该方法仅对PRRSV和PCV2检测为阳性,而对PRV、CSFV、PEDV、TGEV检测结果均为阴性,表明其特异性较好。检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%,利用国标荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对42份临床样品进行检测,二者对PRRSV和PCV2检测的符合率分别可达96.4%和100%。研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于PRRSV和PCV2的双重定量检测。

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_(t)值与标准品在1.0×10^(9)~1.0×10^(2)copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。

三种分子诊断技术诊断结核病敏感度、特异度分析

分析结核病中TaqMan探针荧光定量PCR、GeneXpertMTB/RIF、RNA恒温扩增法三种分子诊断技术的诊断敏感度、特异度。方法 实验时间为2023年1月-2024年1月,选取该阶段内我院收治的疑似结核病患者,共计200例,均接受TaqMan探针荧光定量PCR、GeneXpertMTB/RIF、RNA恒温扩增法诊断,以临床最终诊断结果为“金标准”,比对三种分子诊断技术的准确性、诊断效能。结果 临床最终诊断结果显示200例患者中有170例阳性确诊为结核病,30例阴性排除结核病。GeneXpertMTB/RIF分子诊断技术的敏感性、准确性、阴性预测率均比RNA恒温扩增法、TaqMan探针荧光定量PCR要高(P<0.05)。结论 在结核病诊断中GeneXpertMTB/RIF的诊断敏感性、准确性均较高,能够为临床诊断提供客观支持。

乙肝标志物模式与HBV-DNA定量的比较分析

目的 :探讨乙型肝炎标志物模式与 HBV-DNA复制水平之间的关系。方法 :采用 EL ISA法检测乙型肝炎病毒标志物 ,采用荧光定量探针 PCR法 ( fluorogenic quantitative PCR,F Q-PCR)检测 HBV-DNA。结果 :310例血清标本中 ,H Bs Ag,HBe Ag,H Bc Ab( +)组的平均拷贝数为 10 7.32± 1 .2 8,阳性率为 10 0 % ;H Bs Ag,HBe Ab,HBc Ab( +)组的平均拷贝数为10 4 .6 9± 1 .4 0 ,阳性率为 47% ;H Bs Ag,H Bc( +)组的平均拷贝数为 10 5.0 4± 1 .4 3,阳性率为 5 0 % ;HBe Ab,HBc( +)组的平均拷贝数为 10 4 .94± 2 .72 ,阳性率为 11.8% ;HBs Ab ( +)组的平均拷贝数为 10 4 .71± 1 .56 ,阳性率为 14 .3% ;阴性组的平均拷贝数为10 4 .38± 1 .2 8,阳性率为 12 .5 %。HBs Ag,HBe Ag,HBc Ab( +)组的平均拷贝数显著高于其它各组。结论 :FQ-PCR可以更为清楚地反映乙肝患者的病程变化情况及更为真实地反映 HBV的感染和复制情况 ,对临床诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义。

IMS-qPCR检测水源性微小隐孢子虫方法的建立

目的将免疫磁珠分离技术(IMS)和荧光探针定量PCR(qPCR)相结合,建立水源性微小隐孢子虫卵囊的检测方法。方法以抗微小隐孢子虫卵囊表面抗原Cp23单克隆抗体包被链霉素磁珠,制备特异免疫磁珠,根据卵囊回收率优化分离和富集卵囊条件。根据微小隐孢子虫核糖体DNA小亚基(18S rDNA)基因(登录号AB513881.1)序列设计引物和荧光标记探针,以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,将扩增产物克隆至Peasy-T1载体。经筛选鉴定后,将重组质粒倍比稀释至104～108copy/μl,荧光探针定量PCR检测,并绘制标准曲线。用荧光探针定量PCR分别检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬隐孢子虫和大肠埃希菌基因组DNA,判断该方法的特异性;检测100～108copy/μl重组质粒,判断该方法的敏感性。对采自河北某奶牛养殖场的50份污水样品,分别采用免疫荧光分析法(IFA)和IMS-qPCR检测,并比较分析检测结果。结果磁珠与Cp23单克隆抗体的最佳孵育浓度为20 ng/ml,最佳孵育时间为30 min,最佳捕获时间为30 min,卵囊的回收率>95%。PCR扩增产物长度为272 bp,重组质粒经酶切和测序鉴定正确。荧光探针定量PCR结果显示,重组质粒拷贝数与Ct值之间呈现良好的线性关系,相关系数r2=0.996 1。特异性和敏感性检测结果显示,仅微小隐孢子虫有扩增条带,最低10 copy/μl微小隐孢子虫卵囊18S rDNA重组质粒可被检测到。以IFA检测结果为金标准,50份水样的检测结果显示,IMS-qPCR的特异性为100%(18/18),敏感性为93.8%(30/32)。结论 IMS-qPCR可用于检测水源性微小隐孢子虫卵囊。

鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。