六株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学分析

对 6株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学进行了分析 .6株菌与nifHDK基因有杂交 .菌株总DNA经BamHⅠ酶切后与pEA9 DNA进行Southern杂交 ,只有 2株菌具有完整的质粒DNA ,其余菌株质粒DNA发生了 15 3～ 137 7kb不同程度的缺失 .用切割位点较少的限制性内切酶XbaⅠ酶切 6株菌的总DNA ,经脉冲场凝胶电泳 (PFGE)后用pEA9 DNA为探针进行Southern杂交 ,每株菌的pEA9 DNA明显大于用BamHⅠ酶切后的杂交结果 ,表明质粒与染色体发生了整合 .转座子Tn5或插入序列IS 12 2 2和IS 12 71可能参与质粒与染色体的整合过程 .

豌豆根瘤菌转移接合子侵染的白三叶草根部形态特征研究

以三叶草根瘤菌野生型菌株Rhizobium trifolii ANU 843的寄主范围基因转移豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)菌株300所获得的转移接合子290接种白三叶草。接种后24小时根毛细胞开始形成典型的弯曲;接种后48小时根毛细胞壁被部分溶解,在被侵染的根毛细胞中可观察到侵染线,皮层细胞大量分裂。植物接种试验表明,白三叶草接种豌豆根瘤菌菌株300的不结瘤,而接种转移接合子290和菌株ANU 843的能结瘤,表明三叶草根瘤菌的寄主范围基因导入豌豆根瘤菌,改变了豌豆根瘤菌的寄主范围,因而能够诱导白三叶草正常结瘤。

气单胞菌RD_2及其质粒消除菌和接合子的裂解气相色谱研究

以热裂解产物为分类鉴定依据的裂解气相色谱法是鉴定、鉴别高分子化合物的一种色谱技术。自Oyama用裂解气相色谱法研究微生物细胞以来,随着仪器的不断改进和完善,国内外学者已将其应用到更为广泛的研究领域。事实证明,裂解气相色谱法用于生物材料的鉴定、鉴别和分析也将成为一种灵敏、准确、重现性高的快速方法。

接合子细胞强化对生物反应器降解2，4-D效应研究

研究了接合性质粒pJP4在2株纯菌E.coli DH5α、Alcaligenes sp.及好氧颗粒污泥混合菌群中的水平转移情况,并以获得pJP4质粒的接合子Alcaligenes sp.::pJP4为强化菌种,考察了接合子细胞强化对好氧颗粒反应器和生物膜反应器中难降解有机物2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的去除效应.结果表明,pJP4质粒能在E.coli DH5α、Alcaligenes sp.及好氧颗粒污泥中发生水平转移.在2,4-D为唯一碳源及半连续流运行条件下,向好氧颗粒污泥反应器中投加接合子细胞Alcaligenes sp.::pJP4,使系统对2,4-D的平均降解速率提高了12%～1 498%.在混合碳源及序批式运行条件下向生物膜反应器中投加Alcaligenessp.::pJP4,使启动时间从16 d缩短到了5 d.通过基因强化获得高效接合子,并以其作为生物强化菌种,可以提高生物反应器对特定污染物的去除能力.

强力霉素抗性基因目标供体菌、受体菌和接合子的筛选及鉴定

目的为进一步研究环境中病原微生物目标供体菌强力霉素抗性基因(Dox)水平传播机制奠定基础。方法以强力霉素抗性基因为筛选指标,通过药敏试验从7个菌株中筛选出遗传型分别为Dox^RX^S的候选供体菌和Dox^SX^R的候选受体菌(X代表不是强力霉素的抗生素),将供、受体菌共培养后筛选出遗传型为Dox^RX^R的接合子。分别测定X对目标供体菌、Dox对目标受体菌的最小抑菌浓度。对目标供、受体菌从形态学、生理生化、分子生物学和BIOLOG方面进行鉴定。结果研究的7个病原菌均为多重耐药,最多能耐受15种抗生素,对链霉素、萘啶酮酸和磺胺二甲嘧啶的耐药率最高(100%),对庆大霉素、诺氟沙星和环丙沙星的耐药率最低(0%)。目标供体菌、受体菌和接合子Con-Ⅱ基因型分别为Dox^RKan^S、Dox^SKan^R和Dox^RKan^R。Kan对目标供体菌的最小抑菌浓度为0.310 0μg/mL,Dox对目标受体菌的最小抑菌浓度为0.048 8μg/mL。目标供体菌(Dox^RKan^S)鉴定为Escherichia coli O157:H7(E.coli O157:H7),目标受体菌TR-M30-1(Dox^SKan^R)鉴定为产酸克雷伯菌。结论目标供体菌为E.coli O157:H7(Dox^RKan^S),目标受体菌为TR-M30-1(Dox^SKan^R),接合子为Con-Ⅱ(Dox^RKan^R)。

假单胞菌属细菌中整合子的分布及其可转移耐药性研究

目的研究临床分离假单胞菌属细菌中Ⅰ、Ⅱ类整合子分布及其可转移耐药情况。方法将Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因通用引物置于同一反应体系,对假单胞菌属细菌以多重PCR法检测其整合子的分布,并对整合酶基因阳性菌进行接合转移,最后对接合转移成功菌以平板稀释法测其临床株和接合子MIC值。结果Ⅰ类和Ⅱ类整合酶基因在临床分离假单胞菌属细菌中检出率分别为38.1%和2.2%,含整合酶基因的接合子在转移成功接合子中所占比率为13.6%。结论Ⅰ类整合子在假单胞菌感染的临床分离株中所占比例已相当高,但水平传播率还较低。

猪源氟喹诺酮耐药大肠杆菌通过接合水平传递耐药性的研究

为研究猪源大肠杆菌中可移动质粒在氟喹诺酮类药物耐药性水平传播机制中的作用,作者对氟喹诺酮耐药且PMQR基因阳性的大肠杆菌进行接合试验,并对所得接合子采用微量肉汤稀释法测定其对8种常见药物的最小抑菌浓度(MIC),针对质粒介导的氟喹诺酮耐药基因(PMQR)设计特异性引物对接合子进行PCR扩增。研究结果显示,41株氟喹诺酮耐药且PMQR基因阳性的供体菌共接合成功16株细菌,接合成功率高达39%,接合子与受体菌J53相比,均呈现一定的耐药表型,与供体菌相比,87.5%的接合子存在耐药谱型的变化,并且存在丢失一种药物耐药性,产生另一种药物耐药性的现象,PCR结果显示,接合子与供体菌相比,基因型有所减少,接合子中qnrS基因接合成功率最高,12.5%的接合子发生oqxA、oqxB和qnrS的共转移。本研究表明不同的PMQR基因在可移动质粒介导耐药性水平传播的过程中接合成功率存在差异,不同的PMQR基因有可能位于不同的可移动质粒上,通过比较接合前后供体菌和受体菌耐药表型的变化,尤其是PMQR基因检出率的变化,可以初步确定,可移动性质粒在大肠杆菌耐药性水平传播的过程中起到了非常重要的作用。

大肠杆菌-链霉菌高效接合载体的构建及其应用

以链霉菌质粒SCP2 的衍生质粒pHJL4 0 0为基础 ,构建了能够在大肠杆菌到链霉菌之间进行高效接合转移的质粒pGH112。pGH112含有在大肠杆菌和链霉菌中复制起始位点 ,以及分别在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗性标记。用pGH112转化EscherichiacoliET12 5 6 7(pUZ80 0 2 )后 ,与天蓝链霉菌 (StreptomycescoelicolorA3(2 ) )、除虫链霉菌 (Streptomycesavermitilis)、变铅青链霉菌 (StreptomyceslividansTK5 4 )、毒三素链霉菌 (StreptomycestoxytriciniNRRL15 4 4 3)、委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces.venezuelaeISP5 2 30 )和红色糖多孢菌 (Saccharopolyporaerythraea)进行接合 ,发现本文构建的pGH112与pKC1139相比 ,接合转移效率较高 ,稳定性好 ,而且宿主范围较广。把组成型启动子ermE 与绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到本文构建的pGH112 ,通过接合转移到链霉菌中 ,gfp获得表达 ,证明其可以用作基因接合转移的有效工具载体 。

大肠埃希菌I类整合子携带率及可转移耐药率研究

目的研究大肠埃希菌I类整合子携带率及可转移耐药的发生率。方法用I类整合酶基因通用引物对临床分离大肠埃希菌进行PCR检测,并对阳性菌株进行接合转移实验。结果大肠埃希菌I类整合酶基因阳性率为70.8%;质粒的转移接合率为51.4%。I类整合子的接合成功菌株仅占接合子的3.1%。结论大肠埃希菌中I类整合子的存在非常普遍,耐药性的质粒传播也时有发生,整合子的质粒传播概率相对较低。

换挡齿轮结合子部分的齿端倒角及齿厚收缩的加工

在机械换挡变速箱中,经常采用始终处于旋转的滑动齿套,通过变速杆作用轴向移动,使其内齿与变速齿轮的结合子外齿啮合或脱离来实现变速(图1)。

食源性乳杆菌中耐药基因的转移研究

为评估食品中乳杆菌(Lactobacillus spp.)耐药基因转移所引起的食品安全风险,对耐药乳杆菌菌株进行了红霉素、万古霉素和氟喹诺酮类药物耐药基因的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)中检测到红霉素耐药基因msr C,万古霉素和氟喹诺酮类药物耐药基因检测结果为阴性。以供体菌和受体菌菌液体积比为10∶1,通过滤膜杂交法,进行乳杆菌耐药基因msr C对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的体外转移,但仅获得1个接合子菌落;乳杆菌对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)msr C基因体外转移频率约为2.2×10-2,与敏感菌相比,接合子生长速率减缓。在无特定病原体(specific pathogen free,SPF)裸鼠肠道内进行的L.delbrueckii对E.faecalis的msr C基因体内转移中未检测到接合子。结果表明,乳杆菌携带的可转移耐药基因在肠道内传递至致病菌或机会致病菌的机率很小,且接合子生长比敏感菌缓慢,在抗生素选择压降低或消失的条件下易被淘汰。因此,目前食源性乳杆菌中耐药基因可能引起的食品安全风险较小。

oqxAB基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行及传播

目的了解大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中oqxAB基因的流行情况和传播。方法收集72株大肠埃希菌和4u株肺炎克雷伯菌。用PCR扩增oqxAB基因，接合试验验证oqxAB是否存在于质粒上。琼脂稀释法测定环丙沙星对含oqxAB基因接合子MIC和防耐药突变浓度（MPC）。结果72株大肠埃希菌oqxA、oqxB和oqxAB基因阳性分别为15株（15／72）、4株（4／72）和7株（7／72），49株肺炎克雷伯菌分别为4株（4／49）、1株（1／49）和34株（34／49）。大肠埃希菌环丙沙旱敏感和耐药株中oqxAB基因阳性分别为2株（2／16）和5株（5／56），肺炎克雷伯菌分别为8株（s／14）和26株（26／35）。含与不含oqxAB基因大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗菌药物敏感率差异无统计学意义。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌PCR扩增产物序列与GenBank中oqxAB基因登录号AB601773．1和FJ975561．1符合率均为99％。大肠埃希菌质粒接合试验中有4株接合成功，环丙沙星对接合子MIC为0．25～0．5mg／I。，较受体菌提高31～62倍。环丙沙星对接合子MPC为8～16mg／L，较受体菌353高32倍。肺炎克雷伯菌质粒接合没有成功。环丙沙星对肺炎克雷伯菌MIC≤（0.0625mg／L，无沦是否含oqxAB基因，MPC为0．25～0．5mg／L；但MIC为0．25～0．5mg／L时，无沦是否含oqxAid基因，MPC为2～16mg／L。结论oqxcAB基因存在于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中，该基因在大肠埃希菌通过质粒传播，oqxAB基因在环丙沙星耐药和敏感株中检出率差异无统计学意义，表明其介导细菌对环丙沙星是低水平耐药。含oqxAB基因的接合子在喹诺酮类压力选择下能产生高水平耐药。肺炎克雷伯菌在环丙沙星压力下产生高水平耐药与oqxAB基因无关，而与其MIC有关。

嗜麦芽窄食单胞菌L1、L2基因克隆及耐药性转移

目的观察临床分离嗜麦芽窄食单胞菌产L1、L2 β内酰胺酶情况,以及是否伴有耐药性转移。方法PCR法扩增、克隆2种β内酰胺酶基因,并行接合转移试验。结果在30株嗜麦芽窄食单胞菌中,L2基因均为阳性;除3株外,27株菌的L1基因为阳性。接合子能够在含氨苄西林、利福平、萘啶酸的麦康凯培养基上生长并传代;而在含利福平、萘啶酸和亚胺培南(美洛培南、头孢他啶、头孢噻肟)的培养基上未见菌落生长。将接合子增菌后,抽提质粒发现12kb的质粒。结论嗜麦芽窄食单胞菌产生2种β内酰胺酶,氨苄西林的耐药性可从供体菌转移到受体菌,同时伴随12kb质粒的移动。

豌豆根瘤菌共生基因在S.fredii中的表达及共生质粒间的相互作用

通过两亲本接合转移 ,将豌豆根瘤菌 ( Rhizobium leguminosarum bv. viciae) 12 2 9的约 2 5 5 0 kb的共生质粒 p Sym12 2 9分别转入费氏中华根瘤菌 ( Sinorhizobium fredii) HN0 1SR及其消除了共生质粒的菌株 HND10 0中 .在人工培养条件下 ,用 1 4C标记的薄层层析 ( TL C)技术检测转移接合子的结瘤因子 ( L COs)的结果表明 ,转移接合子 HND10 0 ( p Sym12 2 9)产生的 L COs与豌豆根瘤菌 12 2 9相同 .植物盆栽结瘤试验结果表明 ,HND10 0( p Sym 12 2 9)能够在豌豆品种 Nigra上形成白色球状的无效根瘤 ,而豌豆根瘤菌 12 2 9则形成正常的长圆柱状的有效根瘤 .将 p Sym 12 2 9转入 HN 0 1SR后 ,部分接合子表现出与 HND10 0 ( p Sym 12 2 9)相同的结瘤性状 ,而另一部分接合子的结瘤性状与 HN0 1SR相同 ,显示了 HN0 1SR与 12 2 9两菌株异源共生质粒之间结瘤功能的抑制关系 .

固氮花生根瘤菌HN14的构建

利用三亲本杂交，将带有肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｎｉｆＡ基因的重组质粒ｐＣＫ３导入慢生型花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］１４７－３，初筛获得的转移接合子ＨＮ１４。其在盆栽试验中的共生固氮效率明显优于出发菌株１４７－３。

萘质粒转移到大肠杆菌中合成靛蓝的研究

利用含有萘降解质粒的假单胞菌,通过接合和转化,把这种质粒转移到大肠杆菌中,获得接合子和转化子。这种接合子和转化子不仅在L-培养基中能合成靛蓝,而且能在以萘作唯一碳源和能源的培养基中生长繁殖。因此,本工作不仅为微生物合成染料开拓新的途径,而且对研究环境有毒污染物降解菌的遗传工程也具有一定的意义。

双向驾驶型防爆胶轮车变速转换装置研究

矿井下防爆柴油机无轨胶轮车是一种经济、高效的运输车辆,由于巷道狭窄,不便于车辆调头。双向驾驶车辆的诞生,使得往返运输更加快捷、便利。其变速操纵转换装置的结构形式,也给设计者带来多种思路。通过实践证明,气控传动方式是既安全又经济的首要选择,它与机械的结合是实现自动化操纵的重要手段。了解国情现状,不断更新产品结构,将使我国地下防爆无轨胶轮车的应用范围更加广阔。

Improving Plant Transformation Using Zygote as the Recipient Cell

Since the first transgenic plant was obtained from tobacco in the 1980's, the transformation of higher plants has been a vigorous field of study using applications of molecular biology. To date, transgenic methods of intro-