接种方式对细胞在三维材料中接种率和分布的影响

考察了静态和动态接种方式对成纤维细胞在胶原-壳聚糖支架材料中接种率和分布的影响。将人成纤维细胞制成细胞悬液,分别采用静态接种、转瓶接种和灌注接种方式将细胞接入三维胶原-壳聚糖海绵。通过MTT法和切片HE染色分别考察细胞接种率及细胞在三维材料中的分布。实验结果表明:在低的接种密度下静态接种有较高的接种率(88·9%),但随着接种密度的增加接种率下降显著,细胞结团且分布不均匀;转瓶接种的接种率约为60%,细胞分布也不均匀;灌注接种的接种率始终维持在77%以上,能得到高的起始细胞密度,且细胞分布均匀,是一种理想的接种方式。细胞接种方式的优化为改善工程化组织的结构和功能、缩短体外构建时间奠定了基础。

细胞接种密度对间充质干细胞成骨能力的影响

目的 研究初始细胞接种密度对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。方法 将经体外培养扩增后的人骨髓间充质干细胞制成不同浓度的细胞悬液 ,与载体 (人冻干松质骨 )结合后植入裸鼠皮下 ,在植入后 2、 4和 8周对植入物进行组织学观察和骨量的测定。结果 植入物的骨量受初始细胞接种密度影响 ,稳定成骨的最低接种低密度是 1× 10 5cells/ml,植入物的骨量 ,在一定范围内随接种密度的升高而增加 ,接种密度≥ 5× 10 6cells/ml后骨量不再有显著变化。结论 人的骨髓间充质干细胞体内成骨能力受初始细胞接种密度的影响。

CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验结果的影响

考察了CHO细胞初始接种密度对体外细胞毒性试验结果的影响。通过细胞倍增试验检测不同初始接种密度下CHO细胞倍增时间的差异,并分别采用中性红比色法及MTT比色法检测CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验结果的影响。结果表明,CHO细胞初始接种密度对细胞毒性试验的结果存在一定影响:以2×104～6×104个·mL-1为细胞初始接种密度,CHO细胞在48h内生长速度较为稳定;以4×104～6×104个·mL-1为细胞初始接种密度,中性红比色法毒性试验结果较为稳定;以2×104～4×104个·mL-1为细胞初始接种密度,MTT比色法细胞毒性试验结果较为稳定。在不同的细胞毒性试验中选择适合的细胞初始接种密度有助于提高细胞毒性试验结果的可重复性。

口服髓鞘碱性蛋白与T细胞疫苗接种联合诱导免疫耐受防治实验性自身免疫性脑脊髓炎

目的：口服髓鞘碱性蛋白（ｍｙｅｌｉｎｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）与Ｔ细胞疫苗接种（Ｔｃｅｌｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ＴＣＶ）联合应用诱导免疫耐受，以提高特异性的免疫疗法对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）的防治效果。方法：从ｇｐＳＣＨ／ＣＦＡ诱发ＥＡＥ的ＤＡ大鼠体内取淋巴细胞，体外再以ＭＢＰ刺激，并用ｒＩＬ２促进增殖，反复数个循环，可获得ＭＢＰ特异的Ｔ淋巴细胞系。将此Ｔ细胞系经照射（１５Ｇｙ）灭活处理后，静脉接种至同基因正常ＤＡ大鼠体内，同时给此ＤＡ大鼠多次口服ＭＢＰ诱导耐受，最后以脊髓匀浆／完全福氏佐剂（ＳＣＨ／ＣＦＡ）攻击经上述处理的大鼠，以观察其ＥＡＥ的发病情况。结果：单独口服ＭＢＰ诱导耐受及单独ＴＣＶ处理的ＤＡ大鼠对随后诱发的ＥＡＥ的抑制率分别为６７％和５０％，而将二者联合应用，则抑制率可达８０％。结论：口服ＭＢＰ与ＭＢＰ特异的Ｔ细胞疫苗接种联合应用，可获得更深程度的耐受效果，多种手段联合应用可能成为临床今后通过诱导耐受防治自身免疫病的新策略。

T细胞疫苗接种实验性自身免疫性神经炎的实验研究

目的建立P257-81-特异性T细胞系,在实验性自身免疫性神经炎(EAN)大鼠进行T细胞疫苗接种(TCV)的实验研究。方法P257-81多肽、IL-2和抗CD3/CD28单抗包被磁珠诱导扩增P257-81-特异性T细胞及非抗原特异性T细胞,将灭活T细胞接种大鼠,检测指标包括:瘫痪高峰期最大评分比较,淋巴细胞增殖试验、CD4+T/淋巴结单个核细胞及CD4+CD25+T/CD4+T细胞百分比测定、培养液上清IFN-γ及IL-10水平测定以及坐骨神经病理学检查。结果P257-81-特异性T细胞显著扩增,2周扩增近1000倍;P257-81-特异性TCV预防组无大鼠发病;P257-81-特异性TCV治疗组大鼠病情减轻,其坐骨神经炎性细胞浸润程度显著轻于对照组(P<0.001);P257-81-特异性TCV预防组和治疗组CD4+CD25+ T/CD4+T细胞百分比及培养液上清IL-10水平均显著高于其对照组,培养液上清IFN-γ水平均显著低于其对照组(均P<0.001)。结论抗原+IL-2+CD3/CD28单抗包被磁珠刺激是一种高效、可靠的扩增抗原特异性T细胞方法;P257-81-特异性TCV能预防EAN发生,并可治疗已发生的EAN,其机制可能为:使CD4+CD25+调节性T细胞/CD4+T细胞比例上调,诱导致病性CD4+Th1细胞向保护性CD4+Th2细胞转换。

探讨细胞不同初始接种密度对转染效率的影响

目的:探讨不同初始接种密度对细胞转染效率的影响。方法:利用Lipofectamine 2000(Lipo)介导GCLC基因(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位)及绿色荧光蛋白(GFP)表达载体转染大鼠肺泡上皮L2细胞,通过双萤光素酶报告基因系统检测萤光素酶活性值、荧光显微镜和流式细胞仪检测其GFP表达情况,来探讨细胞不同初始接种密度对转染效率的影响。结果:细胞初始接种密度不同,其转染效率也不同。结论:细胞不同初始接种密度对转染效率有显著性影响,转染细胞数适宜才能得到较高的转染效率。

不同接种方式对组织工程牙龈种子细胞黏附效果的影响

背景:如何在体外将支架材料和种子细胞高效地复合以构建组织工程牙周组织是目前牙周病治疗及牙周缺损修复研究的重要方向。目的:比较传统沉淀接种法和胶原包裹接种法的细胞黏附状况,优化细胞接种方式。方法:将一定浓度的犬牙龈成纤维细胞,分别采用传统沉淀接种法和胶原包裹接种法接种到聚乳酸-壳聚糖-明胶梯度孔径和均匀孔径支架上,通过细胞计数测定支架上贴附的细胞数量,计算其接种率,并进行对比分析。结果与结论:采用胶原凝胶包裹接种法将细胞接种至均匀孔径支架和梯度孔径支架上,其接种率均明显高于传统的沉淀接种法(P<0.01)。用胶原凝胶包裹种子细胞行细胞接种可以有效提高种子细胞的接种率,增加支架上的细胞初始浓度,可以选用胶原凝胶包裹细胞接种方式用于牙龈工程组织构建。

MTT法细胞计数中细胞接种量的确定

在96孔细胞培养板中接种不同数量的CHO细胞,经过48 h和120 h培养后,采用MTT法进行细胞计数,以观察各孔细胞数量是否超出该法的可检测范围。为确保在经过连续培养5 d后各孔细胞数量仍在MTT法的测定范围内,确定出较为合适的细胞接种量非常必要。

天然珊瑚做为成骨细胞接种支架的可行性观察

目的通过观察培养成骨细胞(OsteoblastsOBs)在天然珊瑚(NaturalCoralNC)表面的生长情况来评价其作为骨组织工程支架材料的可行性。方法将NC处理后,用扫描电镜(ScanningElectronicMicroscopeSEM)观察其立体结构,并测定孔径和孔隙率。分离、培养兔颅骨OBs,将细胞按5×106个/ml浓度接种于NC中,通过倒置显微镜、SEM观察OBs在NC表面的贴附、伸展情况,并测定细胞在NC表面生长时的碱性磷酸酶(ALP)活性。结果NC中含有三维交通的孔隙,其孔率约为36%,OBs接种后1d,即可在NC表面贴附并伸展,5d后可长满珊瑚表面,并保持其ALP活性。结论珊瑚对OBs具有良好的相容性,并具有多孔性,适于作为OBs接种的支架而用于骨的组织工程。

人皮肤成纤维细胞与PGA进行组织构建的适宜接种浓度

目的可吸收生物材料聚羟乙酸(PGA)与成纤维细胞已被证实可以应用于体外组织工程肌腱的构建,本试验旨在探讨应用人皮肤成纤维细胞与PGA在体外进行组织构建时的适宜接种浓度。方法酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,按照低、中、高三种浓度接种于PGA材料分别作为实验组1、2、3,传统浓度细胞接种的作为对照组,各组样本数n均为3,分别于接种后3天、1周、2周和4周进行观察和检测。结果接种后3天实验各组无明显差异,细胞在材料上黏附伸展良好。1周和2周时,各组细胞均有明显增殖,并分泌细胞外基质(ECM extra cellular matrix),但实验组1、2的ECM不如实验组3和对照组丰富,此后该现象更为明显。至第4周时,实验组1仅形成厚薄不均的薄膜状物,其余三组均形成组织样结构,但实验组2形成的细胞--材料复合物结构略为松散。结论应用本实验组中高浓度接种皮肤成纤维细胞在体外构建工程化组织可以达到传统所用更高浓度的接种效果,以节约细胞,减少取材。

T细胞接种对环磷酰胺诱导的NOD鼠淋巴细胞亚群的影响

目的 探讨 T细胞接种 (TCV)对 1型糖尿病预防作用的机制。方法 4周龄未发病的雌性 NOD鼠用 18周龄新近发病的 NOD鼠脾细胞制得的 T细胞疫苗接种 ,检测 TCV对环磷酰胺诱导的 NOD鼠淋巴细胞亚群的变化情况。结果 TCV可以诱导宿主脾脏 CD8+ T细胞百分比升高、CD4+ / CD8+比值和 IL- 2 R+细胞下降 ,以及胸腺 CD4+、CD8+单阳性细胞百分比升高。结论 TCV可以诱导宿主产生自身免疫低反应性 ,这种作用可能与宿主脾脏和胸腺淋巴细胞亚群的变化有关。

MV3和HaCaT细胞接种去表皮真皮组织上构建人工皮肤黑素瘤模型(英文)

背景:课题组曾成功的用MV3黑素瘤细胞和人角质形成细胞体外重建黑素瘤三维模型。目的:利用MV3黑素瘤细胞和HaCaT细胞结合去表皮的真皮体外重建黑素瘤模型。方法:MV3黑素瘤细胞和HaCaT细胞按照不同比例混合接种于人去表皮的真皮组织上,采用液下培养和空气-液面培养相结合技术进行培养,体外构建组织工程皮肤模型。对所构建的皮肤黑素瘤模型进行常规切片免疫组化观察。结果与结论:苏木精-伊红染色显示MV3黑素瘤细胞在去表皮真皮表面成层分布或形成瘤灶,HaCaT细胞和瘤细胞混合生长,形成典型的表皮样结构。部分瘤细胞浸润到去表皮真皮浅层或内部,成瘤灶分布。CK10、CK-pan和S-100免疫组化染色显示阳性。随着MV3∶HaCaT细胞比例的增高,CK10,CK-pan由表层逐渐下移,由层状分布变为团块状分布,S-100蛋白染色则分层逐渐明显,部分区域成瘤状分布。结果可见利用MV3黑素瘤细胞和HaCaT细胞结合去表皮真皮体外可以构建皮肤黑素瘤模型。

多孔隙三维环境下细胞接种密度对血管平滑肌细胞增殖行为的影响

目的本研究拟在聚乙醇酸支架材料形成的多孔隙三维环境下,探究不同接种密度对人血管平滑肌细胞增殖行为的影响,并确定一个相对合适的接种密度区间,为后续构建组织工程血管选用种子细胞接种浓度进行初步探索。方法将3种不同浓度的细胞悬液接种于聚乙醇酸支架材料上,通过免疫荧光,细胞增殖实验和免疫印迹,观察细胞的形态、黏附、增殖和表型。结果细胞悬液接种后沿着支架材料生长,不同浓度的细胞悬液导致细胞形态、黏附和增殖发生变化,但是细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及Calponin没有明显变化。当细胞悬液浓度为1×10^(7)个/mL时,接种于支架后,细胞掉落的数目最少。当细胞悬液浓度为1×10^(6)个/mL时,细胞增殖标志物增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达最多。结论生长在支架材料上的血管平滑肌细胞的形态,黏附和增殖受到细胞接种浓度的影响,综合比较细胞的形态、黏附、增殖和表型,我们认为最佳的细胞接种浓度应为1×10^(6)个/mL到1×10^(7)个/mL区间。

低强度脉冲超声促进不同接种密度骨髓间充质干细胞增殖的实验研究

目的探讨低强度脉冲超声(LIPUS)促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的可行性及筛选骨髓间充质干细胞适宜的接种密度。方法选取体外培养第3代兔骨髓间充质干细胞接种至20块6孔板,接种密度分别为5×103/mL,1×104/mL,2×104/mL,4×104/mL,8×104/mL。选用频率0.6 MHz,强度为0.2 W/cm2的LIPUS每天分别辐照10 min。辐照前、辐照1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后观察细胞生长情况。MTT法检测LIPUS辐照后各密度组细胞增殖活性并绘制OD值曲线。结果 BMSCs经过LIPUS辐照后,较空白对照组细胞集落更为密集,细胞分裂增殖活性明显活跃。其中以接种密度为2×104/mL辐照后BMSCs增殖活性曲线更加稳定,细胞增殖活性明显高于空白对照组(P<0.05)。结论 LIPUS辐照一定时间后能够促进BMSCs增殖,不同的接种密度的骨髓间充质干细胞增殖活性不一,其中接种密度为2×104/mL细胞增殖活性曲线更加稳定,为更加适宜的接种密度。

树突状细胞接种——肿瘤免疫治疗的新策略

肿瘤的免疫学治疗方法一直得到广泛的研究。由早年的非特异性免疫增强剂到后来的LAK,TIL过继免疫治疗,随着基础免疫学对免疫应答、T细胞活化机制认识的逐步深入,人们对肿瘤免疫逃逸机制亦有了新的认识,进而产生了旨在增强肿瘤免疫原性治疗肿瘤的一系列新方法。这些新方法包括:将某些细胞因子基因转染人肿瘤细胞。

来源于人胎肝干细胞的肝癌细胞系建立及初步研究

目的:研究肝癌细胞发生发展及变化规律,探讨胎肝干细胞体外长期培养的变异归宿问题. 方法:原代分离培养人胎肝干细胞,从中筛选出一生长旺盛之集落,体外长期培养,并对其生物学特性进行初步鉴定.进行了细胞倍体分析;应用流式细胞仪分析了细胞周期;在Scid鼠体内接种细胞进行成瘤性验证. 结果:从人胎肝组织中成功分离出一胎肝干细胞集落,在体外长期培养下可分化为肝癌细胞.其细胞增值核抗原指数高达100%;倍体分析常见多倍体细胞;流式细胞仪分析细胞周期,结果G1期细胞约占48%,G2期细胞约占18%,S期细胞约占34%.Scid鼠体内成瘤实验显示,接种细胞后2-3 wk 成瘤,具有100%的成瘤性.显微镜下所见细胞大小不一,异型性明显,核仁大,核分裂活跃. 结论:人胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞,确实可分化为肝癌细胞.从人胎肝干细胞中分离培养出肝癌细胞对于肝癌发生发展及其变化规律的深入研究奠定了基础.

富血小板血浆对牙周韧带成纤维细胞在牙骨质表面附着及增殖的影响

目的探讨应用富血小板血浆(PRP)对人牙周韧带成纤维细胞(PDLFs)在健康牙和牙周病患牙牙骨质表面附着和增殖情况的影响。方法采用组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,取第四代细胞用于实验。分别制备健康牙和牙周病患牙牙骨质块置于96孔板,附着实验在接种细胞后加入含10%PRP和不含PRP的培养液,4小时后MTT法检测附着细胞数量;增殖实验在接种细胞常规培养24小时,而后加入不含血清的培养液培养48小时,更换为含10%PRP和不含PRP的培养液,24小时后MTT法检测细胞数量;并以扫描电镜观察细胞在牙骨质表面的情况。结果附着实验中10%PRP组附着细胞数量较不含PRP组明显增多;增殖实验中10%PRP组和不含PRP组细胞数量无明显差异。结论10%PRP可促进人PDLFs在健康牙和牙周病患牙牙骨质块上的附着,但对细胞在牙骨质块上的增殖无明显影响。