蟾酥对大鼠气管体外诱癌与鸡胚皮肤接触培养的抑癌作用观察

本研究用 Sprague-Dawley 大鼠气管体外诱与鸡胚皮肤接触培养的方法,通过倒置显微镜、光镜和扫描电镜观察了蟾酥的抑癌作用。结果表明:(1)诱发性大鼠气管癌变细胞,具有向鸡胚皮肤侵袭性生长的生物学行为。同时证明蟾酥对大鼠气管体外诱癌过程具有抑制作用。(2)蟾酥具有逆转大鼠气管上皮的异型性鳞状化生,促进气管受损粘膜的修复和保护气管上皮正常分化的作用。(3)在 MCA 作用下可见纤毛细胞增生和化生。

骨髓间充质干细胞与胶质瘤细胞非接触共培养后相关生物学特性分析

目的在体外通过大鼠胶质瘤C6细胞与大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)非接触共培养,以探明BMSCs是否受到肿瘤微环境的作用获得肿瘤细胞的相关生物学特性。方法通过6孔板结合Transwell小室建立BMSCs和C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,设单独培养的BMSCs为对照组;相差显微镜下观察培养后2组细胞形态学的改变;核干细胞因子(nucleostemin,NS)检测细胞增殖力的变化;荧光定量PCR和Western blot检测细胞中mdm2、p53mRNA水平及其蛋白的变化;免疫荧光法检测神经胶质细胞特异的胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)在细胞中的定位及表达。结果共培养后实验组细胞呈现类似胶质瘤细胞样的形态,表达神经胶质细胞特异的GFAP蛋白;NS蛋白反映的细胞增殖能力未发生改变;共培养后实验组p53mRNA水平明显低于对照组(P<0.01),而p53蛋白的表达水平显著高于对照组[(1.63±0.31)vs(0.85±0.12),P<0.05];实验组mdm2mRNA及其蛋白的表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。结论肿瘤微环境可能会使大鼠骨髓间充质干细胞获得肿瘤细胞的相关生物学特性。

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的:探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法:分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞,MSCs以1×105个/ml接种于共培养板内孔,第1代软骨细胞以1×104个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中,补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照,观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果:实验空白组在7d和14d,Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达,符合MSC特性。非接触共培养1周后,Ⅱ型胶原蛋白阳性表达,与空白对照比较,P<0.01,具有统计学意义;非接触共培养2周后,Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达,与空白对照比较,P<0.01,同样具有统计学意义;实验14d组与实验7d组比较,P<0.01,具有非常显著性差异。结论:软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。

非接触共培养条件下骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化

背景:组织工程中间充质干细胞治疗椎间盘退变性疾病为退变椎间盘结构和功能恢复提出了一种新型的治疗方案,是目前研究的热点。目的:分析兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能。方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞与兔髓核细胞按培养要求分为3组:普通6孔板单纯培养骨髓间充质干细胞组,普通6孔板单纯培养髓核细胞组,骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养组,Transwell 6孔板底部接种第3代骨髓间充质干细胞,上层接种第3代髓核细胞。倒置显微镜观察各组细胞形态的变化,在培养第7天采用免疫细胞化学、RT-PCR及Western blot技术测定各组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论:(1)共同培养第7天,骨髓间充质干细胞呈多角形、短梭形改变,无纤维样变化,形态接近髓核细胞;(2)共培养组骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达与单独培养髓核细胞组相近,显著高于单独培养骨髓间充质干细胞组;(3)结果表明,非接触共培养条件下,髓核细胞具有诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供大量的细胞来源。

非接触共培养法诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞的分化

背景:最近研究表明将乳鼠心肌细胞和骨髓间充质干细胞非接触共培养后,可成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞。目的:尝试通过非接触共培养方式,利用人脐静脉内皮细胞诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化。设计、时间及地点:细胞组织工程学体外实验,于2007-01/07在广东省人民医院医学研究中心完成。材料:骨髓标本来源于11例无血液系统疾病的先天性心脏病患儿,征得家属同意后在心脏矫治手术中从胸骨柄穿刺获取少量骨髓用于实验。足月顺产健康新生儿脐带由中山大学附属一院产科协助取得。新鲜牛颈静脉由广东大沥菜牛屠宰厂提供。方法:取骨髓标本,以密度梯度离心法分离纯化人骨髓间充质干细胞,并在体外扩增培养;以酶消化法自新生儿脐带获取人脐静脉内皮细胞。采用具有半透膜的细胞培养池结合6孔板的方式进行非接触共培养诱导,将人脐静脉内皮细胞铺于培养池内,第3代骨髓间充质干细胞以1×105/孔铺在培养池外的6孔板内,两种细胞的初始比例为1:5,加入含体积分数为0.1胎牛血清的低糖DMEM培养液,培养14d。以骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞共培养作为对照组。诱导后的内皮样细胞扩增培养,种植在脱细胞牛颈静脉血管支架上。主要观察指标:诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后内皮样细胞表面相关抗原,扫描电镜观察内皮样细胞在血管支架上的生长黏附情况。结果:诱导后的内皮样细胞形态均一,呈铺路石状排列,扩增迅速,表达内皮细胞特有的表面标志CD31和vWF,阳性率均>99%,可以在脱细胞牛颈静脉血管支架表面形成连续的单细胞层。结论:非接触共培养方式下,人脐静脉内皮细胞可成功诱导人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并能够在脱细胞牛静脉血管支架上黏附生长。

Transwell 接触共培养促进单散iPSCs 生长及分化

目的：观察Transwell接触共培养促进单散人诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells， iPSCs）生长及分化的作用。方法：将1～2代牛角膜内皮细胞（corneal endothelial cells， CECs）接种在Transwell 小室底面培养8 h后，应用Accutase消化及40μm过滤处理获得单散iPSCs，将其接种到已有CECs的Transwell小室内共培养14 d，前3 d使用mTeSR1培养基，第4天开始用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。分别进行实时荧光定量聚合酶链式反应（ real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ， qPCR ）、免疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ， ALP）染色，对iPSCs多能特性表达及分化进行鉴定。设定单散iPSCs共培养组为实验组，常规培养iPSCs组为对照组（一），非共培养单散iPSCs组为对照组（二）。结果：培养牛CECs形态呈典型的六边形铺路石样外观。人iPSCs呈克隆样生长，共培养3 d后iPSCs贴壁呈单散细胞生长，免疫荧光检测未分化标志Nanog和Oct4呈阳性。 qPCR检测Nanog、Oct4和Sox2 mRNA表达，实验组与对照组（一）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。死活细胞染色显示，实验组死细胞明显减少，与对照组（二）比较差异有统计学意义（P＜0.01）。共培养14 d后，人iPSCs形态比较均一，呈多边形，体积增大，无明显克隆团块；ALP染色阴性；免疫荧光染色ZO-1、AQP1和CD31表达阳性，CD34和CD133表达阴性。 qPCR检测Oct4、Nanog和Sox2 mRNA表达明显下调，与对照组（一）比较差异有统计学意义（P＜0．01）。结论：与牛CECs共培养可增强人单散iPSCs活性，使iPSCs形态上向内皮样细胞转化，表达部分CECs的标志。 Transwell接触共培养模型可以促进单散iPSCs生长及分化。

非接触式共培养下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学影响的比较研究

目的:比较非接触式共培养条件下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一腰椎间盘突出症患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和退变髓核细胞(NPCs),两种间充质干细胞分别与髓核细胞在Tanswell 6孔板中进行非接触式共培养,与ADSCs共培养的NPCs为A组,与BMSCs共培养的NPCs为B组,以单独培养的NPCs为对照组。共培养7d后,提取3组髓核细胞总RNA,进行反转录后,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。结果:非接触式共培养7d后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量对照组分别是1.03±0.28、1.21±0.40和0.94±0.34,A组分别是3.49±0.55、3.88±2.11和2.41±0.91,B组分别是7.60±1.89、6.26±2.96和4.55±1.88。与对照组相比,A、B组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达显著增加(P<0.05);A、B两组间相比也有显著性差异(P<0.05)。结论:非接触式共培养条件下骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞均有一定的激活效应;骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞的激活效应更强,可能更加适合于椎间盘退行性疾病的生物学治疗。

采用接触式培养皿和棉拭子进行手套表面细菌的检测效果分析

目的:评价接触式培养皿和传统棉拭子对于静脉配置中心工作人员手套表面细菌采样的检测效果。方法:分别用接触式培养皿和棉拭子这两种常用的细菌采样方法,对静脉药物配置中心的配置人员在配置过程中的不同时间段的手套表面进行采样、培养、计数,比较采样效果。结果:接触式培养皿所测得的菌落数与棉拭子采样法无明显差异(P>0.05),而接触式培养皿测得的菌落阳性率要明显高于棉拭子采样法(P<0.05)。结论:当手部细菌量较少的情况下,接触式培养皿对细菌的检测效果优于棉拭子。

接触共培养对干细胞向心肌细胞分化影响的研究进展

心肌梗死后,存活的心肌细胞减少、而心肌又无法通过再生修复,使得心肌的收缩能力降低,最终导致心脏衰竭。目前的治疗手段中,包括药物治疗、手术治疗等,但是无法逆转心肌细胞数目减少的问题。心脏移植作为替代疗法,存在供体十分有限以及免疫排斥反应等问题。因此,细胞移植的治疗方法有望成为一种有效治疗手段,在恢复心功能具有广阔的前景。在移植细胞方面,在提高其分化效率方面,有很多种方法,包括药物诱导法、微环境诱导法、接触共培养法、基因修饰法等。

两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较

目的:比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞(NPCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs。共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs。然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P<0.05为有统计学差异。结果:从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs。待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs。经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加(P<0.05);C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加(P<0.05)。结论:在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。

黄芪多糖体外对非接触共培养HUVECs细胞诱导SGC7901细胞转移的影响

目的探索黄芪多糖体外对人血管内皮细胞HUVECs诱导的胃癌细胞系SGC7901细胞EMT转化及其转移的影响。方法 MTT检测黄芪多糖对HUVECs、SGC7901细胞增殖抑制的影响。建立Transwell细胞共培养系统,并分为SGC7901组(单独培养SGC7901细胞)、HUVECs/SGC7901组(共培养HUVECs/SGC7901细胞)、黄芪多糖组(黄芪多糖干预共培养HUVECs/SGC7901细胞),Transwell实验检测各组SGC7901细胞侵袭能力,qRT-PCR检测各组细胞E-cadherin、Vimentin mRNA表达,免疫荧光检测各组细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达,Western blot检测各组细胞LOX、Snail1蛋白表达。结果与单独培养的SGC7901细胞相比,共培养的SGC7901细胞侵袭能力,MMP-2、MMP-9、LOX、Snail1蛋白及Vimentin mRNA表达均升高(P<0. 01),E-Cadherin mRNA表达下降(P<0. 05)。经黄芪多糖干预后,共培养的SGC7901细胞侵袭能力、MMP-2、MMP-9、LOX、Snail1蛋白及Vimentin mRNA表达下降(P<0. 01),ECadherin mRNA表达升高(P<0. 05)。结论与HUVECs细胞共培养可激活SGC7901细胞EMT转化,促进SGC7901细胞转移,但黄芪多糖可通过抑制EMT转化阻止非接触共培养人血管内皮细胞诱导的SGC7901转移。

非接触共培养条件下软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化

背景:在非接触共培养条件下,软骨细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞。骨膜细胞作为软骨修复的种子细胞,其与软骨细胞共培养的作用及影响鲜有研究。目的:通过软骨细胞与骨膜细胞非接触共培养,利用软骨细胞诱导骨膜细胞向软骨细胞分化。方法:采用胰酶、Ⅱ型胶原酶消化法分离兔关节软骨细胞;组织块培养法分离兔骨膜细胞。分别取第2代软骨细胞和骨膜细胞,按1∶1比例通过transwell培养板进行非接触共培养作为实验组,单纯骨膜细胞培养作为对照组。培养2周后,倒置显微镜观察2组细胞形态;Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色检测2组细胞的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成;RT-PCR检测2组细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1和性别决定区Y框蛋白9 m RNA表达水平。结果与结论:(1)培养2周后,实验组共培养骨膜细胞逐渐变为类圆形软骨细胞形态,对照组骨膜细胞仍为长梭形;(2)实验组共培养骨膜细胞的Ⅱ型胶原免疫组化、甲苯胺蓝染色均为阳性,对照组为阴性;(3)RT-PCR结果显示,实验组共培养骨膜细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原α1、性别决定区Y框蛋白9 mR NA相对表达量明显高于对照组;(4)结果提示,非接触共培养条件下,软骨细胞可以诱导骨膜细胞向软骨细胞分化。

人原代肺动脉内皮-平滑肌接触式共培养方法的技术改进

目的:改进人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)-人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)接触式共培养方法 ,为更好模拟体内两种细胞间相互作用提供研究平台。方法:采用微孔聚碳酸酯膜为载体,将HPAECs和HPASMCs接种于微孔膜两侧,建立HPAECs-HPASMCs联合培养模型以模拟正常血管壁两种细胞的结构关系,通过调整细胞种植密度、培养时间、培养液体系、培养基种类、血清浓度等,倒置相差显微镜、Hoechst染色及流式细胞术比较不同条件下接触式共培养模型中细胞贴壁、生长和凋亡的差异,免疫荧光染色观察优化共培养条件后细胞标记物的表达变化。结果:(1)明胶预包被Transwell膜可促进内皮细胞的黏附和生长;(2)渗透压升高增加内皮细胞凋亡;(3)内皮细胞培养基较DMEM、RPMI1640更有利于接触式共培养模型的建立;(4)内皮细胞生长因子为1%、胎牛血清为2%时两种细胞生长稳定;(5)优化共培养条件对两种细胞的自身特性无显著影响。结论:当培养体系为内皮细胞培养基、维持1%内皮细胞生长因子及2%胎牛血清组分条件,可建立稳定的HPAECs-HPASMCs接触式共培养模型,为体外模拟人肺动脉血管壁结构功能和研究两种细胞间相互作用构建了良好平台。

接触皿培养基的制备及质量验证

目的:摸索接触皿培养基配方及制备工艺,评价接触皿培养基的效果。方法:用国产原料配方制备接触皿培养基,按《中华人民共和国药典》中规定的灵敏度试验方法,将本实验室制备的接触皿培养基与商品化RODAC培养基进行灵敏度比较试验,以及接触皿培养基与商品化RODAC培养基在洁净间监测应用中对比试验。结果:本实验室制备的接触皿培养基与商品化RODAC培养基进行灵敏度效果比较试验中活菌数无显著差异;菌落直径无显著差异。在洁净间监测应用对比试验中的细菌检出率无显著差异。结论:本实验室制备的接触皿培养基灵敏度效果及洁净间监测应用中的细菌检出率能满足要求,且成本低于商品化的RODAC培养基。

细胞接触对NK细胞及DC间免疫调节的影响

目的探讨自然杀伤细胞(NK)促进树突状细胞(DC)成熟及诱导细胞因子产生的作用,及是否依赖于细胞接触。方法体外培养NK及未成熟DC,并按1∶5、1∶1、5∶1的比例进行接触与非接触式共培养,抗CD86-FITC标记抗体流式细胞术分析DC的CD86表达水平,酶联免疫吸附法检测培养液中TNF-α、IL-12p40含量。结果随着NK/DC比例的升高,表达CD86+DC增多,而DC分泌的TNF-α、IL-12p40呈指数量降低,非接触共培养使DC表达CD86及分泌TNF-α、IL-12p40明显降低。结论NK具有促进DC成熟的作用,并能调节DC细胞因子的分泌,这种免疫调节作用依赖于细胞间接触。

DiI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与乳鼠心肌细胞在聚己内酯薄膜上接触共培养制作心肌补片的实验研究

目的探讨在聚己内酯薄膜上将DiI标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs)与乳鼠心肌细胞接触共培养制作心肌补片的可能机制。方法选取5~6周龄SD大鼠2只,分离培养获得SD大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定表面抗原。选取乳鼠15只,分离培养获得乳鼠心肌细胞。BMSCs培养至3代,使用DiI染料标记BMSCs。在聚己内酯薄膜上将DiI标记的BMSCs与心肌细胞接触共培养并设为实验组,对照组中将心肌细胞替换为等量未标记的BMSCs。共培养后24 h在荧光显微镜下观察细胞生长情况,并用扫描电镜观察共培养情况。共培养后7 d对细胞进行免疫荧光染色检测心肌标志物表达,在荧光显微镜下观察聚己内酯薄膜上BMSCs表达心肌标志物的情况。共培养的第1、7天使用流式细胞术分析BMSCs的干细胞分化率。使用钙黄绿素单独对心肌细胞染色,再在聚己内酯薄膜上将其与DiI标记的BMSCs接触共培养,观察细胞间染料转移,并对细胞进行免疫荧光染色,检测缝隙连接蛋白43的表达,观察缝隙连接与接触共培养之间的关系。结果流式细胞术鉴定示BMSCs表面CD90、CD44H强阳性,CD11b/c、CD45阴性。共培养后24 h,荧光显微镜下观察到细胞依附于聚己内酯薄膜上,DiI标记的BMSCs发红光,未标记的心肌细胞不发光;扫描电镜下观察到聚己内酯薄膜上细胞数量多,细胞状态正常。共培养第7天,部分DiI标记的BMSCs表达心肌肌钙蛋白T、α-心肌肌动蛋白。流式细胞术分析示第7天实验组的干细胞分化率高于对照组[(20.12±0.15)%比(3.49±0.20)%,P<0.05]。共培养后第2天,缝隙连接蛋白43免疫荧光染色结果示部分BMSCs可见明显绿色点状荧光;共培养后第3天,染料转移试验示部分BMSCs发出明显绿色荧光。结论DiI标记的BMSCs与心肌细胞在聚己内酯薄膜上接触共培养可以制作心肌补片,并且接触共培养促进分化形成心肌补片的机制可能与缝隙连接以及缝隙连接介导的细胞间信号通路有关。

M2型巨噬细胞抑制CD8^(+)T细胞促进食管癌细胞恶性生物行为

目的探讨M2型巨噬细胞通过抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤能力参与食管癌的恶性生物学行为的作用。方法利用佛波酯(PMA)联合白细胞介素4(IL-4)/IL-13将人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导为M2型巨噬细胞并用实时定量PCR检测相关炎性因子。运用磁珠分选法分选健康志愿者外周血CD8^(+)T细胞,用流式细胞术验证分选纯度。构建CD8^(+)T细胞与食管鳞癌细胞的非接触性共培养体系(CD8^(+)T细胞),和构建M2型巨噬细胞、CD8^(+)T细胞与食管鳞癌细胞的非接触性共培养体系(M2型巨噬细胞联合CD8^(+)T细胞)。平板克隆实验和CCK-8细胞毒性实验检测各组肿瘤细胞增殖能力。Transwell^(TM)实验检测各组肿瘤细胞侵袭和迁移能力。流式细胞术检测并分析各组肿瘤细胞的凋亡情况。运用GraphPadPrism9.5软件进行统计学分析和制图。结果诱导后巨噬细胞IL-10和精氨酸酶1(Arg1)表达上调,IL-12和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达下降,具有M2表型巨噬细胞特征。磁珠分选法成功的分选出CD8^(+)T细胞,其阳性率>90%。食管鳞癌细胞与CD8^(+)T细胞非接触性共培养组的增殖、侵袭、迁移和抗凋亡能力显著低于单独癌细胞组;而食管鳞癌细胞与M2型巨噬细胞条件培养基预处理CD8^(+)T细胞共培养后,其增殖、侵袭、迁移和抗凋亡能力与食管鳞癌和CD8^(+)T细胞共培养组相比显著增强。结论M2型巨噬细胞通过抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤能力促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和抗凋亡。

共培养体系间充质干细胞对同源内皮祖细胞增殖和血管形成的影响

目的临床干细胞治疗心肌梗死可能归因于细胞旁分泌对细胞存活和血管形成的作用,文中探讨小鼠骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在非接触共培养体系中对同源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖和血管形成的影响。方法小鼠骨髓细胞经差速贴壁法分离MSCs与EPCs,以流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨成脂成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。取第3代MSCs和EPCs,按1∶1的细胞比例接种入Transwell共培养系统中,以下室接种EPCs上室接种MSCs为实验组,同时设置相同密度单纯EPCs接种于下室为对照组。采用MTT比色法和Ed U荧光标记法检测MSCs对EPCs增殖能力的影响,采用计数血管样结构数目和联结点数目检测MSCs对EPCs血管形成能力的影响。结果第3代MSCs经FCM检测高表达Sca-1,CD29低表达CD45,CD11b;经诱导可向成骨成软骨成脂方向分化。第3代EPCs经FCM检测高表达CD34、CD133和VEGFR2,在基质胶上可形成血管样结构。MTT比色法和Ed U荧光标记法结果显示与对照组相比,实验组细胞的增殖能力在72 h后显著增强(P<0.05);实验组DNA合成期的细胞比例较对照组显著增多[(89.00±5.30)vs(76.00±3.38),P<0.01)]。倒置显微镜观察结果显示实验组EPCs生成的血管样结构和联结点数目较对照组明显增加[(13.53±2.33)vs(10.80±1.82)、(16.60±2.23)vs(13.07±2.81),P<0.05]。结论利用差速贴壁法可同时分离纯化扩增MSCs和EPCs。EPCs在和MSCs非接触共培养时其增殖能力和血管形成能力都得到提高。

与内生真菌共培养对葡萄果肉细胞生理生化影响的差异研究

根据与内生真菌共培养过程中对葡萄细胞生理生化的影响差异将内生真菌菌株归类,筛选出具有不同利用价值的内生真菌资源。以分离于玫瑰蜜、赤霞珠和夏黑葡萄叶片的18个属47株内生真菌和佳美葡萄(Vitis vinifera L.cultivar:Gamay)果肉愈伤组织为试验材料,构建内生真菌与葡萄细胞共培养体系,并探索这些内生真菌菌株对葡萄果肉细胞生长、花色苷含量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性等的生理生化影响。结果表明,与不同内生真菌共培养对葡萄细胞生长、花色苷总量和PAL活性都有不同程度的影响。其中共筛选出20株对葡萄细胞伤害较小的内生真菌;6株显著促进葡萄细胞生长的内生真菌;11株显著促进葡萄细胞PAL活性的内生真菌;5株促进葡萄细胞花色苷总量的内生真菌。此次研究为发掘和利用内生真菌资源调控葡萄生化品质特征提供了技术参考和一定的物质基础。

不同共培养模式下间充质干细胞对造血干细胞增殖的作用

背景:虽然进行了大量相关研究,但目前仍缺乏切实可行的体外扩增造血干细胞的方法。间充质干细胞能分泌多种促进造血干细胞增殖并抑制其分化的细胞因子,在维持造血微环境及调控造血干细胞功能中发挥着重要的作用。目的:探讨不同共培养模式下骨髓间充质干细胞在体外对造血干细胞增殖的影响。方法:采用全骨髓贴壁法体外培养C57BL/6小鼠间充质干细胞至P3代,采用miniMACS磁珠分选仪分选GFP小鼠(C57系)骨髓CD117^+细胞(造血干细胞),采用不同共培养模式将2种细胞进行共培养:对照组为造血干细胞单独培养组;实验组为Transwell共培养组(上室接种造血干细胞、下室接种间充质干细胞);2D接触共培养组(24孔板共同接种造血干细胞与间充质干细胞)。分别于共培养1,3,5,7 d于倒置相差显微镜、荧光显微镜下观察造血干细胞的形态,并检测造血干细胞的活性细胞数。结果与结论:共培养1-7 d,各组造血干细胞数量均随着培养时间的增加而增加(P<0.05)。各组细胞自3 d开始进入对数生长期,5 d时部分造血干细胞开始出现形态变化。比较第7天造血干细胞活性细胞数,可知与间充质干细胞共培养的实验组及2D接触共培养组均明显高于对照组(P<0.05):而2D接触共培养组造血干细胞数明显高于非接触培养的实验组(P<0.05)。结果提示:间充质干细胞在体外能够有效促进造血干细胞增殖,接触共培养条件下其促进作用更明显。