非接触式共培养下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学影响的比较研究

目的:比较非接触式共培养条件下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一腰椎间盘突出症患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和退变髓核细胞(NPCs),两种间充质干细胞分别与髓核细胞在Tanswell 6孔板中进行非接触式共培养,与ADSCs共培养的NPCs为A组,与BMSCs共培养的NPCs为B组,以单独培养的NPCs为对照组。共培养7d后,提取3组髓核细胞总RNA,进行反转录后,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。结果:非接触式共培养7d后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量对照组分别是1.03±0.28、1.21±0.40和0.94±0.34,A组分别是3.49±0.55、3.88±2.11和2.41±0.91,B组分别是7.60±1.89、6.26±2.96和4.55±1.88。与对照组相比,A、B组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达显著增加(P<0.05);A、B两组间相比也有显著性差异(P<0.05)。结论:非接触式共培养条件下骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞均有一定的激活效应;骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞的激活效应更强,可能更加适合于椎间盘退行性疾病的生物学治疗。

两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较

目的:比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法:取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞(NPCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和骨髓间充质干细胞(BMSCs)。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs。共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs。然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P<0.05为有统计学差异。结果:从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs。待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs。经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加(P<0.05);C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加(P<0.05)。结论:在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。

人原代肺动脉内皮-平滑肌接触式共培养方法的技术改进

目的:改进人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells,HPAECs)-人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)接触式共培养方法 ,为更好模拟体内两种细胞间相互作用提供研究平台。方法:采用微孔聚碳酸酯膜为载体,将HPAECs和HPASMCs接种于微孔膜两侧,建立HPAECs-HPASMCs联合培养模型以模拟正常血管壁两种细胞的结构关系,通过调整细胞种植密度、培养时间、培养液体系、培养基种类、血清浓度等,倒置相差显微镜、Hoechst染色及流式细胞术比较不同条件下接触式共培养模型中细胞贴壁、生长和凋亡的差异,免疫荧光染色观察优化共培养条件后细胞标记物的表达变化。结果:(1)明胶预包被Transwell膜可促进内皮细胞的黏附和生长;(2)渗透压升高增加内皮细胞凋亡;(3)内皮细胞培养基较DMEM、RPMI1640更有利于接触式共培养模型的建立;(4)内皮细胞生长因子为1%、胎牛血清为2%时两种细胞生长稳定;(5)优化共培养条件对两种细胞的自身特性无显著影响。结论:当培养体系为内皮细胞培养基、维持1%内皮细胞生长因子及2%胎牛血清组分条件,可建立稳定的HPAECs-HPASMCs接触式共培养模型,为体外模拟人肺动脉血管壁结构功能和研究两种细胞间相互作用构建了良好平台。

非接触共培养条件下骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化

背景:组织工程中间充质干细胞治疗椎间盘退变性疾病为退变椎间盘结构和功能恢复提出了一种新型的治疗方案,是目前研究的热点。目的:分析兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能。方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞与兔髓核细胞按培养要求分为3组:普通6孔板单纯培养骨髓间充质干细胞组,普通6孔板单纯培养髓核细胞组,骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养组,Transwell 6孔板底部接种第3代骨髓间充质干细胞,上层接种第3代髓核细胞。倒置显微镜观察各组细胞形态的变化,在培养第7天采用免疫细胞化学、RT-PCR及Western blot技术测定各组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论:(1)共同培养第7天,骨髓间充质干细胞呈多角形、短梭形改变,无纤维样变化,形态接近髓核细胞;(2)共培养组骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达与单独培养髓核细胞组相近,显著高于单独培养骨髓间充质干细胞组;(3)结果表明,非接触共培养条件下,髓核细胞具有诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供大量的细胞来源。

人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导髓核细胞退变的保护作用

背景:人脐带华通胶间充质干细胞移植到犬退变椎间盘模型中可存活,恢复部分椎间盘高度,但其对炎性损伤后髓核细胞是否有修复治疗作用目前还没有文献报道。目的:观察人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导大鼠髓核细胞退变的保护作用。方法:将第3代SD大鼠髓核细胞分3组培养,对照组用含胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;白细胞介素1β组以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;实验组先以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,再更换完全培养基与人脐带华通胶间充质干细胞非直接共培养24 h。采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪测定3组髓核细胞凋亡率,RT-PCR测定各组髓核细胞基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂1的表达,caspase试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。结果与结论:(1)白细胞介素1β组、实验组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),实验组低于白细胞介素1β组(P<0.05);(2)白细胞介素1β组、实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量高于对照组(P<0.05),基质金属蛋白酶抑制剂1表达量低于对照组(P<0.05);实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量低于白细胞介素1β组,基质金属蛋白酶抑制剂1表达量高于白细胞介素1β组(P<0.05);(3)白细胞介素1β组、实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性高于对照组(P<0.05),实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性低于白细胞介素1β组(P<0.05);(4)结果表明,人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导的髓核细胞退变凋亡有明显的抑制作用。

人胚胎干细胞对A549、HepG2细胞增殖与凋亡的影响

本研究以探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,h ESCs）对肿瘤细胞A549、Hep G2增殖与凋亡的影响为目的,以h ESCs、A549细胞、Hep G2细胞作为研究对象,采用transwell小室在体外分别建立h ESCs与A549、Hep G2细胞的非接触式共培养的方法,设置Co-A549、Co-Hep G2作为实验组,单独培养的A549、Hep G2细胞作为对照组,采用CCK-8法检测细胞增殖水平,Hochest33258染色和流式细胞术检测细胞的凋亡,q RT-p CR和Western blotting检测Bcl2、Bax及Caspase-3的m RNA转录水平和蛋白表达水平。CCK-8检测显示,实验组细胞的增殖受到显著抑制（p〈0.05）,Hochest33258染色观察到实验组细胞出现核固缩、变形,流式细胞术检测到实验组细胞的凋亡率显著高于对照组（p〈0.05）,q RT-p CR和Western blotting显示h ESCs可上调实验组细胞Bax、Caspase-3的表达,下调Bcl2的表达（p〈0.05）。由此我们得到人胚胎干细胞对肿瘤细胞A549、Hep G2有明显的增殖抑制作用并可诱导A549、Hep G2肿瘤细胞的凋亡的结论,为干细胞治疗肿瘤的研究奠定了实验基础。