接触抑制对转化生长因子β诱导基因22(TSC-22)在心脏成纤维细胞中表达的影响

目的通过建立体外原代培养的新生大鼠心脏成纤维细胞模型,研究接触抑制对TSC-22表达的影响,并为进一步探明TSC-22在心脏成纤维细胞中的确切功能奠定基础。方法采用差速贴壁法原代分离培养Sprague-Dawley大鼠心脏成纤维细胞,分别进行下述实验:①以不同初始密度接种细胞,分为两组:A组为50%融合组:以1.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;B组为100%融合组:以2.0×105/ml密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,培养24h;②均以2.0×105/ml的初始密度接种细胞于T25细胞培养瓶中,分为4组:A组为未融合组:接种后培养6h(至贴壁未融合状态);B组为融合组:接种后培养24h(至100%融合状态);C组为胰酶消化打破融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养6h(此时细胞重新贴壁但未融合);D组为胰酶消化重新达融合组:接种后培养至100%融合后,0.25%胰酶消化,离心混悬后重新贴壁,继续培养24h(此时细胞重新达到100%融合)。以上各组分别提取mRNA和蛋白,应用实时定量PCR(real-time PCR)、蛋白印记(Western blotting)法分别检测TSC-22 mRNA、蛋白表达的变化。结果实时定量RT-PCR和蛋白印记结果表明:①心脏成纤维细胞融合度达到100%,即发生接触抑制时,与50%融合度组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平水平均显著升高(P<0.05);②融合组心脏成纤维细胞与未融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高;胰酶消化打破融合组心脏成纤维细胞与融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著下降;胰酶消化重新达融合组成纤维细胞与胰酶消化打破融合组相比,TSC-22的mRNA和蛋白水平均显著升高(P均<0.05)。结论本实验结果明确表明,在体外培养的心脏成纤维细胞中,接触抑制是诱导TSC-22表达升高的重要因素。当心脏成纤维细胞发生接触抑制时,TSC-22可能通过行使其转录因子的生物学功能,在接触抑制后所触发的信号通路中发挥重要调控作用。对TSC-22确切功能的深入研究,将有助于进一步理解和阐明心脏重构机制。

IL-22调控EAM小鼠心肌纤维化的初步研究

目的:探究IL-22在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)发展后期心肌纤维化中的作用及其可能的机制。方法:重组质粒pET28a-IL-22转化和鉴定生成包涵体后,通过变性、复性和纯化得到可溶性蛋白。Western blot、免疫荧光、qRT-PCR检测纤维化相关指标表达水平。ELISA检测细胞培养上清中TGF-β的水平;Western blot检测Smad3及其磷酸化的情况。天狼星红染色检测心脏纤维化的程度;qRT-PCR检测心脏组织中CollagenⅠ/Ⅲ的mRNA表达情况。结果:经过变性、复性和纯化后得到IL-22可溶性蛋白。IL-22降低CollagenⅠ和α-SMA的表达,下调CollagenⅠ/ⅢmRNA的水平。IL-22抑制TGF-β水平及Smad3信号分子的活化。IL-22可以缓解EAM小鼠晚期心脏纤维化进程。结论:IL-22通过抑制血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)激活的TGF-β下游Smad3信号途径缓解EAM小鼠心脏纤维化。