用不提取核酸PCR扩增孕妇血浆中胎儿游离DNA的SRY和FMR1基因

目的建立一种不提取核酸的孕妇血浆中胎儿游离DNA的检测方法。方法构建不提取核酸PCR法,用巢式PCR扩增Y染色体上的SRY基因序列和X染色体上的FMR1基因序列,检测44例孕妇血浆中游离DNA。根据随访判断结果的准确性。结果 44例孕妇经随访确认24例有男性胎儿,20例有女性胎儿。24例孕男性胎儿的孕妇血浆标本中有21例扩增出SRY基因和FMR1基因,敏感性为87.5%(21/24);20例孕女性胎儿的孕妇血浆标本中有17例扩增出FMR1基因,敏感性为85.0%(17/20)。结论建立的不提取核酸PCR法具有快速、简便等优点,可用于性连锁遗传病的产前诊断。

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)热灭活咽拭子及热灭活后提取核酸样本在4℃保存的稳定性研究

目的研究56℃30 min热灭活后的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)咽拭子及提取的核酸在4℃保存的稳定性。方法采用多重荧光定量PCR方法对一例COVID-19患者的咽拭子样本,56℃30 min热灭活后进行COVID-19双靶点(ORF1ab和N基因)核酸检测,把原始咽拭子样本及提取的核酸保存在4℃,分别于24,48,72和96h再次检测咽拭子样本及提取核酸中新冠病毒核酸的含量(Ct值),分析热灭活后咽拭子样本及提取核酸在4℃保存的稳定性。结果COVID-19患者的咽拭子样本,56℃30 min热灭活后核酸检测结果为ORF1ab和N基因双阳性,Ct值分别为31.27和30.64,咽拭子样本4℃保存24,48,72和96h后再次检测ORF1ab和N基因的结果为24h(31.41和30.68),48h(34.13和34.28),72h(34.06和34.11)和96h(36.22和40.02)。提取的核酸4℃保存24,48,72和96h后的检测结果为24h(31.64和30.06),48h(31.62和29.95),72h(31.72和29.75)和96h(31.36和30.09)。56℃30 min热灭活的咽拭子样本在4℃保存24h后,对COVID-19核酸的检测无明显影响(偏倚<1%),但4℃保存48~72h,ORF1ab基因核酸降解约7倍,N基因降解约11倍,4℃保存96h,ORF1ab和N基因核酸分别降解30.91倍和666.29倍。但是提取的核酸4℃保存24~96h后,对核酸的检测结果无明显影响(偏倚均小于3%)。结论研究结果表明56℃30 min热灭活后提取的核酸的稳定性比原始咽拭子样本好,热灭活后的咽拭子样本可在4℃保存24h。

PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR方法,试验根据GenBank中PRRSV类NADC30毒株NSP2基因设计引物和探针,建立了直接对样品中PRRSV类NADC30毒株检测的荧光定量RT-PCR方法。对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评估,并对临床样本进行检测。结果表明:建立的PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR方法的扩增体系(20μL)为2×PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix 10μL,PRRSV类NADC30毒株液1μL,NADC30-F(15μmol/μL)0.8μL,NADC30-R(15μmol/μL)0.8μL,NADC30-P(15μmol/μL)0.4μL,灭菌纯化水7μL。扩增程序为90℃3 min;60℃5 min;95℃5 s, 54℃20 s (收集荧光信号,选择FAM通道),40个循环。该法特异性好,对其他猪常见病原无交叉反应。对PRRSV类NADC30毒株液的最低检测限度为3.98 TCID_(50)/100μL,与传统提取核酸的荧光定量RT-PCR检测方法敏感性一致。不同病毒含量样本组内和组间变异系数均不高于2%,具有良好的重复性和稳定性。临床样本检测结果与传统荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。说明建立的PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR检测方法特异性好、敏感性高,具有良好的重复性和稳定性,可用于PRRSV类NADC30毒株的临床检测。

磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用研究

目的 观察评价分析磁珠法在提取核酸HIV-RNA检测中的应用效果。方法 选择2017年7月至2019年3月期间中山市第二人民医院爱心门诊经确诊艾滋病毒感染并接受抗病毒治疗的患者100例,运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量;随机对照试验分为两组,对患者的血清标本进行检测,对照组50例给予酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测HIV抗体,观察组50例给予磁珠法检测HIV抗体,并比较两组患者的检测准确率、敏感度及特异性。结果 观察组的检测准确率为96.00%,显著高于对照组的68.00%(χ^2=13.2791,P=0.0000);观察组检测敏感度与特异性分别为100.00%、100.00%,显著高于对照组的21.43%、18.18%(χ^2=36.2353、30.4615,均P<0.05)。结论 运用磁珠法分离提取纯化核酸,荧光定量PCR检测系统及柱提取核酸荧光定量PCR检测系统测定病毒核酸HIV-RNA载量,在艾滋病血清HIVRNA检测中,磁珠法的临床检测准确率、特异性、敏感度得到大幅度提高,在检测操作时方便、快捷、高效,值得临床检验科医师大力推广应用。

手动提取核酸的注意事项

RT-PCR的指数扩增是一项很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。目前,市级动物疫病预防控制中心均可开展此项检测,但由于市级只对各种重大动物疫病的病原进行初步检测,检测任务量不是很多, RNA的提取多由手工操作。文中笔者就实际操作中的注意事项和大家分享。

不同核酸提取方法对HBV-DNA检测性能验证情况分析

目的评估2种乙型肝炎病毒(HBV)-DNA提取方法及2家检测试剂的性能,有助于选择优化提取试剂和检测试剂。方法2023年4月采用达安全自动核酸提取仪提取法(磁珠法)和手工提取法(一步法),并用达安和圣湘2种HBV-DNA试剂检测,对其进行精密度、正确度、线性范围、检出限及抗干扰能力等性能进行验证和评价。结果达安全自动核酸提取仪提取达安试剂检测、手工提取达安试剂检测和手工提取圣湘试剂检测在精密度、正确度、线性范围、检出限方面验证结果均达标;达安全自动核酸提取仪提取圣湘试剂检测在低值检测中变异系数大于5%,最低检测限验证不合格;抗干扰能力方面,全自动核酸提取仪提取的2.0 g/dL血红蛋白浓度的样本用达安和圣湘试剂检测结果均不受影响。手工提取甘油三酯浓度达3000 mg/dL的样本用达安和圣湘试剂检测的结果均不受影响。结论不同厂家的提取和检测试剂避免混用,达安和圣湘试剂对HBV-DNA定量检测的结果均符合要求。

核酸提取试剂盒对饲料中牛羊源性成分检测的影响

实时荧光聚合酶链反应法(荧光PCR法)是目前饲料中牛羊源性成分的定性检测中常用方法之一。为了熟练操作和掌握这个方法,使得实验室工作人员在做饲料中牛羊源性成分定性这类检测时能有一个清晰的认识,通过核酸提取试剂盒的选取及平行实验比对,对此进行了阐释。

一种可用于OBI检测的高灵敏度核酸提取方法的建立与验证

目的 建立和验证1种可用于隐匿性HBV感染(OBI)检测的大体积高灵敏度核酸提取方法,并将其应用于低病毒载量OBI标本的定量检测。方法 参考罗氏核酸检测试剂盒核酸提取方法,建立1种大体积核酸提取方法。将HBV标准品分别配置成10 000 IU/mL、1 000 IU/mL、100 IU/mL、10 IU/mL和1 IU/mL浓度,采用磁珠法从10 mL相应浓度的标准品中提取核酸,采用荧光定量PCR法检测各浓度的CT值,每个浓度梯度进行平行双份检测,以病毒浓度的对数为X轴,2次检测CT值的平均值为Y轴,构建荧光定量标准曲线和回归方程。通过3次重复实验验证该方法的稳定性。应用本方法提取低病毒载量OBI标本核酸并进行荧光定量。结果 3次HBV病毒荧光定量标准曲线扩增效率(E)均在90%~105%,回归方程(R2)均>0.99。不同浓度标准品CT值的变异系数(CV)分别为0.63%、0.78%、1.52%、1.36%和0.78%。本方法可以提取出病毒载量低至1 IU/mL的OBI标本核酸并进行定量。结论 本方法HBV核酸定量检测系统检测下限可达1 IU/mL,并且具有较强稳定性和灵敏度,可用于低病毒载量OBI的定量检测。

壳聚糖改性凹凸棒土对食源性致病菌核酸提取效果的影响

利用壳聚糖对凹凸棒土(attapulgite,ATP)进行表面改性,考察改性对ATP吸附性能的影响,并建立基于壳聚糖-ATP的DNA提取方法,以实现食源性致病菌基因组DNA的低成本、高效提取。利用X射线衍射光谱等手段对材料进行表征,并利用吸附动力学模型和吸附等温模型考察改性材料对DNA的吸附机制。以3种食源性致病菌基因组DNA为提取对象,考察提取量、纯度、完整性和提取方法的可靠性。结果表明,准一级动力学模型和Freundlich模型能更好地模拟吸附结果,壳聚糖改性可显著提高ATP的吸附性能,壳聚糖-ATP对DNA饱和吸附量为23.648μg/mg,提取的基因组DNA完整性好、纯度高,且提取方法的重复性好。

磁珠法核酸提取设备的专利申请现状

为了获取基于磁珠法核酸提取装置相关的国内外申请状况的基本数据,本文在incoPat数据库中选择“磁珠or磁5W粒”和“核酸提取”和“装置or设备or仪or系统”等关键词进行检索,总共获得1 410件专利申请,其中国内申请1 258件,国外152件。通过对数据不同维度的分析,探讨了该领域相关专利申请的趋势、全球申请人情况、主要分类号等方面。

核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的效率评价

柑橘易受到不同遗传类型病原的复合感染,传统病原检测方法需单一核酸提取,使得检测步骤繁琐,影响检测效率。以普通单一核酸提取试剂盒为对照,采用核酸共提取试剂盒,通过分析核酸完整性和浓度以及病原检测效率,以期探讨核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的可行性,从而简化柑橘病原检测方法的核酸提取步骤。结果表明,相比普通RNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取RNA的完整性、纯度、浓度以及柑橘衰退病毒病原检测效率均无显著差异,可达到相同检测效果。相比普通DNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取DNA的完整性、纯度均无显著性差异,但其浓度显著降低,使得柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原检测效率也显著降低;通过增加PCR反应的起始模板量,核酸共提取试剂盒检测柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原的效率与普通DNA试剂盒无显著差异,可达到相同检测效果。综上所述,核酸共提取试剂盒可应用于柑橘危险性病害检测,将有助于提高病原复合感染样品的检测效率。

全自动核酸提取仪对不同类型ASFV、PEDV样品的提取效果

研究以非洲猪瘟病毒(ASFV)的各类型阳性样品以及流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品为检测对象,评测全自动核酸提取仪对DNA和RNA核酸的提取效果,旨在帮助动物疫病检测实验室了解如何评测全自动核酸提取仪是否满足检测需求。试验选用已经过检测结果为阳性的不同类型ASFV样本和PEDV阳性的粪便拭子样品,进行10倍梯度稀释并将检测结果与已知的检测原值进行对比。结果显示,试验使用的核酸提取仪的稳定性满足需求,但敏感性较差,可能存在环境、人员、车辆等病毒含量低的样品被漏检。在抗干扰方面,试验使用的核酸提取仪对咽喉拭子的核酸提取结果存在假阴性的情况;该仪器对肛门拭子和环境样品的抗干扰性不佳,也可能出现假阴性结果;该仪器不会受样品影响而检测出假阳性结果。

核酸提取仪用多轨道注射泵设计与研究

适用于核酸提取仪的多轨道注射泵是一种新型注射泵,可以将少量药液通过单轨道或多轨道等多种注射方式准确、均匀、连续地泵入体内。文章根据多轨道注射泵的特点设计了一款适用于核酸提取仪的多轨道注射泵。在分析多轨道注射泵工作原理的基础上,设计了多轨道注射泵电机、泵体和柱塞泵等关键部件,并对多轨道注射泵进行了相应的传动受力分析计算,从而验证了设计的可行性。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

不同核酸提取方法在EB病毒和人巨细胞病毒检测中的效果

目的:评价三种不同核酸提取方法在EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)和人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)核酸检测中的性能和临床应用价值。方法:采用手工柱提法、手工磁珠法及全自动磁珠法平行提取核酸,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)测定EBV和HCMV的DNA,评估检测精密度、线性范围、最低检出限;选择2023年12月苏州大学附属第四医院的35份临床样本进行临床应用评价,同时评估手工磁珠法与全自动磁珠法核酸提取的线性关系。结果:3种方法在精密度方面的CV值均小于5%,在样本浓度为10^(2)~10^(7)拷贝/mL均具有良好的线性关系,最低检出限验证结果也均合格;在临床应用评价中,手工柱提法相较于其他两种方法检测阳性率更高,但差异无统计学意义(P>0.05),手工磁珠法与全自动磁珠法在EBV和HCMV样本的检测中具有良好的相关性。结论:三种核酸提取方法对EBV和HCMV样本的定量检测结果均符合要求,可根据不同样本量的检测需求选择合适的提取方法,以降低实验成本,提高检测效率。

不同全自动核酸提取仪对ASFV、PEDV提取效果的比较

【目的】以倍比稀释的ASFV(非洲猪瘟病毒)阳性对照样品以及PEDV(猪流行性腹泻病毒)阳性对照样品为检测对象,对比3款全自动核酸提取仪对DNA和RNA的提取效果,旨在帮助猪场配备的实验室筛选合适、可靠的全自动核酸提取仪。【方法】倍比稀释好的ASFV、PEDV阳性对照样品,每个梯度设置3个平行重复,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)为处理1,西安天隆核酸提取仪(NP968-C)为处理2,博日核酸提取仪(NPA-32P)为处理3,根据3款全自动核酸提取仪及提取试剂盒的说明书将对应阳性样品进行核酸提取,再根据英迪康的virotype?非洲猪瘟病毒2.0 PCR检测试剂盒以及世纪元亨的流行性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒的说明书进行体系配制、上样、程序设置,进行核酸扩增。【结果】同一浓度梯度的ASFV、PEDV阳性对照样品,处理3所提核酸的扩增结果 CT值较处理1和处理2的低,而处理1和处理2提取效果不相上下。【结论】3款核酸提取仪的稳定性都满足需求;博日核酸提取仪(NPA-32P)的提取效果优于另外2款,诺维赞核酸提取仪(VNP-32P)和西安天隆核酸提取仪(NP968-C)的提取效果接近。

3型腺病毒免提取核酸重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法的建立及应用

目的 建立3型腺病毒(human adenovirus 3,HAdV-3)免提取核酸的重组酶介导的等温扩增(recmbinase acid amplification,RAA)实时荧光检测方法。方法 根据HAdV-3基因保守序列分别设计1对引物和1条探针,通过对免提核酸的条件摸索和优化,建立1种免提取核酸,重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法;通过对培养的毒株进行系列稀释,免提取核酸分析该方法的灵敏度;通过检测其他呼吸道病毒的原始样本,评价该方法的特异性;并检测HAdV-3临床样本,与传统的提核酸实时荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的免提取核酸实时荧光RAA方法对10倍系列稀释的HAdV-3毒株进行检测,和实时荧光定量PCR方法相比,灵敏度相当,对应的最低浓度稀释样本的Ct值为36.87,对常见其他型别的呼吸道病毒检测无交叉反应。两种方法对56例HAdV-3阳性临床样本同时检测,结果完全一致。结论 本文首次报道了免提取核酸的实时荧光RAA检测HAdV-3的方法,该方法具有较高的灵敏度和特异性,适合应用于临床实验室及基层单位快速检测HAdV-3。

三种核酸提取方法检测禽流感病毒的比较

为比较不同核酸提取方法检测禽流感病毒敏感性的差异，将 H5N1禽流感抗原做10－2-10－10稀释，分别用 Trizol 法、磁珠法和膜吸附法提取上述抗原稀释度核酸模板，采用荧光 RT-PCR 对其进行评价。结果表明，在不同稀释度的抗原的检测中，3种核酸提取方法以膜吸附法提取效率最高，其依次为磁珠法、Trizol 法，经方差分析，3种核酸提取方法之间存在显著性差异（P＜0．05）。说明 3种核酸提取方法提取效率存在显著差异，核酸提取效率的高低影响禽流感病毒荧光 RT-PCR 检测的敏感性，建议实验室根据实际情况选择核酸提取的方法。

一种改良的鞘翅目昆虫核酸的提取方法

介绍了一种简单快速地提取鞘翅目昆虫核酸的方法。以异色瓢虫和青杨脊虎天牛为试验材料，采用改良的CTAB法分别提取这2种昆虫不同部位的核酸。电泳检测和紫外分光光度分析结果表明，改良的CTAB法提取的DNA和RNA具有较高的质量和纯度，其A260／A280分别为1.7-1.9和1.9-2.0。RT-PCR和ISSR-PCR分析结果表明，利用该方法提取的总RNA和总DNA可用于基因克隆和分子标记等下游技术实验。

HS9600全自动核酸提取仪的研制

将核酸提取工艺与自动控制相结合,研发了 HS9600全自动核酸提取仪。该仪器以机械臂运动控制为核心,结合移液器定量控制与试剂技术,实现了核酸的分离与纯化。文中详细介绍了机械臂位置控制系统、移液器控制系统、温控系统等关键模块的设计方法,并描述了系统软件的功能和设计思想。检测证明该仪器运动控制稳定,可靠性好,提取效果优,自动化程度高。