芜菁花叶病毒提纯技术的研究

将繁殖于大白菜上的病叶榨汁,结合聚乙二醇(PEG)沉淀及差速离心技术,拟定三种提纯程序,所得芜菁花叶病毒(TuMV)粗提纯物,可侵染芜菁、萝卜和大白菜,并在苋色藜和普通烟黄茵榆上产生局部枯斑。测定提纯物表现出典型的核蛋白紫外吸收光谱,在电镜观察下,其丝状病毒粒子形态清晰且排列疏松均匀、病毒粒子长度集中分布在730nm、宽12～13nm。用水醋酸分解、可获得本病毒的提纯的衣壳蛋白,它具有典型蛋白质紫外吸收光谱,上述三种提纯程序中,以第三种程序最佳。初步认为,若设备不足情况下省用蔗糖密度梯度离心步骤,仅用第三种提纯程序,亦可获得较好提纯效果。

河南小麦梭条斑花叶病病原鉴定、病毒提纯及其特性

经鉴定,我国河南邓县冬小麦上发生的一种病毒病的病原,是小麦梭条斑花叶病毒。 对病毒的分离纯化进行了研究,提出了一个简单可靠的病毒纯化程序,获得了较为理想的提纯病毒制品,提纯病毒具有典型的、核酸含量约为5～6％的线状病毒紫外吸收曲线,病毒粒体宽约12nm,长度分布从200～2000nm以上,平均粒体长度约为1000nm,在300nm、600nm及1000nm处有3个分布高峰,用提纯病毒免疫兔子获得效价为1/1024的抗血清,提纯病毒的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到多条蛋白带,分子量从36.6kd至28.6kd,其中36.6kd的蛋白为病毒的外壳蛋白,其余的为外壳蛋白的降解产物。

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒（WSSV）的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落，用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子，对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后，可以获得大量完整的病毒粒子。用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液，感染螯虾（Cambarus proclarkii），选取25％的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液，然后经蔗糖密度梯度离心，分取各带负染后电镜观察，大量完整的病毒位于46％-52％蔗糖梯度之间，病毒粒子末端带有很长的尾；而病毒裸露的核衣壳位于40％～46％蔗糖梯度之间；在57％～62％之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌。实验结果表明改进的病毒提纯方法较好，可得到大量完整的带囊膜的病毒颗粒。

鸭瘟病毒提纯方法比较

将鸭瘟病毒CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞（DEF）进行培养增殖后，收集病毒液，分别采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖不连续密度梯度离心法进行了鸭瘟病毒的提纯研究，结果表明，DEF增殖与蔗糖不连续密度梯度超速离心法是鸭瘟病毒较好的增殖和提纯方法，病毒粒子主要存在于400～500g·L^-1蔗糖层上；经20g·L^-1磷钨酸负染后电镜观察发现，提纯病毒具典型疱疹病毒特征，大小较一致，为170～190nm，由核芯、衣壳和囊膜3部分组成结构较完整的病毒粒子；采用Bradford法测定，纯化病毒液中病毒含量为0．71mg·mL^-1。

玉米矮花叶病毒提纯及特性的研究

改进病毒纯化方法,获得了较高纯度、较强侵染活性的提纯病毒制品。提纯病毒的产量为0.7—1.2mg/100g病叶,病毒粒体大小为720—750×14nm,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的外壳蛋白分子量为36000道尔顿,用提纯病毒免疫家兔得到较高特异性的抗血清,微量沉淀反应的效价为1/2048,间接ELISA法测出的感病叶汁液的最高稀释倍数为3200—6400倍。

中国水仙上一种球形病毒的研究 Ⅱ.病毒提纯及其生化特性

繁殖于昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)、千日红(Gompherena globosa)及番杏(Tetragonia.expansa)上的病毒分离物,经PEG6000沉淀结合差速离心浓缩后,用Sepharose4B柱层析法进行分离纯化,获得保持侵染活性的病毒纯化物;而且表明,用昆诺阿藜繁殖病毒,效果最优。紫外扫描测定,纯化病毒的最高吸收波长为258nm,最低吸收波长为244nm,A260/A280为1.515。分析超速离心测定,病毒粒体为单一沉降组分,S20.w约73S。SDS-PAGE结果表明,病毒衣壳蛋白亚基由一条分子量为27.88×10~3±2.99×10~3daltons的多肽组成。根据紫外吸收估计,病毒粒体中核酸含量约12—15%;RNaseA酶解及变性处理病毒核酸后琼脂糖变性电泳结果说明,病毒基因组为一条ssRNA。根据该病毒的生物学特性及生化特性,初步确认为一种新的病毒分离物,并定名为中国水仙条纹病毒(Chinese Narcissus Strip Virus,ChNSV),其密码程式为R/1:*/12—15:S/S:S/*。

传染性支气管炎病毒的分离提纯及蛋白电泳分析

通过ＳＰＦ鸡胚接种分别对传染性支气管炎病毒的２ 个标准毒株Ｍ４１、ＩＢＶ－ Ｔ 株，４ 株山东分离株及１ 株北京分离株进行扩增繁殖；利用差速离心法、蔗糖不连续密度梯度离心法进行提纯；用ＳＤＳ－ 聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行蛋白分析。结果表明：各毒株都含有四种结构蛋白，且各毒株结构蛋白分子量基本相似，其中仅Ｍ

动物肠道溶瘤病毒的提纯

本文通过对Ecco-18株病毒的提纯,摸索出了动物肠道溶瘤病毒的较佳提纯方案。

番木瓜环斑病毒的提纯研究

详细报道了影响番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）粗提纯效果的几个主要因素（繁殖寄主种类、有机澄清剂、分散剂、病毒浓缩前的去渣离心力、浓缩病毒的超离心力等）的最佳选择．繁殖寄主以角葫瓜（Ｃｕｃｕｍｉｓｓｍｅｔｕｌｉｆｅｎｉｓ）最好。该研究综合上述最佳选择而拟定的一次差速离心和一次３０％蔗糖硫酸艳连续密度梯度离心３ｈ的简单程序较好地提纯了ＰＲＹ，提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，Ａ２６０／Ａ２８０＝１．６８，提纯产量为２．５６ｍｇ／１００ｇ西葫芦病叶。所得病责制剂可满足血清学、分子生物学等方面的深入研究。

非特异性下腰痛患者晨尿HCMV病毒分离培养及鉴定

目的探讨非特异性下腰痛(NLBP)与人巨细胞病毒(HCMV)感染的关系。方法50例NLBP患者为病例组,与之年龄、性别相仿的36例健康人为健康对照组。各研究对象取2ml空腹中段晨尿接种至人胚肺成纤维细胞中培养,观察HCMV特异性细胞病变效应(CPE);培养物均经PCR检测HCMV UL83DNA。结果NLBP组中HCMV CPE阳性9例,健康对照组均阴性。培养物中,CPE阳、阴性的PCR分别为阳、阴性。组间比较差异有显著性(χ2=5.44,P=0.02)。结论HCMV感染可能是NLBP的病因之一。

人乳头状瘤病毒16在食管癌不同人群中的检出率

背景与目的中国河南省安阳地区是食管癌高发区,有研究发现人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)的感染是安阳地区食管癌的重要发病因素。本文研究HPV16型在中国北方不同地区食管癌患者中的感染率及其表达水平,以进一步明确HPV16与食管癌发病的相关性。方法用地高辛标记的HPV16E6探针做原位杂交(insituhybridization,ISH),检测河南省安阳食管癌高发区的食管癌患者(43例)、北京肿瘤医院散发食管癌患者(43例)和内蒙古自治区蒙古族食管癌患者(33例)的食管癌组织中HPV16的感染情况。结果ISH检查结果显示安阳、北京、内蒙古3个地区食管癌患者HPV16感染率分别为81.4%(35/43)、69.8%(30/43)和63.6%(21/33);安阳食管癌患者HPV16感染水平明显高于北京(H=3.91,P<0.05)和内蒙古(H=4.22,P<0.05)的食管癌患者。安阳食管癌患者中HPV16表达呈阳性、强阳性的比例明显高于北京和内蒙古食管癌患者(H=3.95,P<0.05)。结论HPV16在不同地区的食管癌患者中均有较高感染率。安阳食管癌高发区的患者感染HPV16的程度较严重。

甜菜上一种球状病毒分离物的特性研究

由田间自然感病的甜菜黑色焦枯病株、坏死黄脉型病株及无明显症状的甜菜上分离到一种球状病毒。病毒呈二十面体 ,直径约 2 5nm ,有空心和实心 2种粒子 ,具有分子量为 2 4 7kd的外壳蛋白和长度分别为 3 8kb、1 4kb、1 1kb的 3个双链RNA组分。该病毒具有较强的稳定性和侵染性 ,蚜虫不能传毒 ,土壤诱发可传播 ,易通过汁液摩擦接种侵染多种植物 ;但回接甜菜只偶尔出现个别褪绿斑或不规则褪绿斑 ,并不表现田间症状 。

六安地区手足口病患儿肠道病毒分离鉴定与临床表现

目的对六安地区手足口病流行区患儿标本进行病毒分离与鉴定,为进一步预防和控制该病流行奠定基础。方法采集手足口病患者咽拭子和疱疹液标本,进行病毒分离、中和实验和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)特异性扩增进行鉴定,同时对肠道病毒71型(EV71)抗原决定簇部位VP1区进行核苷酸序列测定与分析。结果14份咽拭子和8份疱疹液标本中分离得到6株病毒,经中和实验、RT-PCR及VP1片段检测与测序证实为EV71型,与BrCr-ts株、台湾分离株、深圳分离株一致性分别为98%、84%和83%。结论该流行区2008年爆发的手足口病病原体为EV71型。

定量和定位检测EB病毒在鼻咽癌组织中的感染状态

背景与目的EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)与鼻咽癌密切相关,但EBV是鼻咽癌的致瘤因素还是仅仅是伴随关系有待进一步研究,而且EBV在鼻咽癌发生过程中的潜伏状态也不明确,本研究通过检测EBV在不同鼻咽组织中的表达变化,为进一步阐明EBV与鼻咽癌发生的关系提供线索。方法应用荧光定量PCR(real-timePCR)技术定量检测47例鼻咽低分化鳞癌患者癌、癌旁及相对正常鼻咽粘膜组织中的平均EBV拷贝数;并采用原位杂交技术(地高辛标记的EBER-1探针)对鼻咽癌、癌旁、对侧正常鼻咽粘膜中的EBV进行定位检测。以10例正常人鼻咽粘膜组织作对照。结果正常人鼻咽粘膜EBV检出率为80%(8/10),平均拷贝数为6.7×102/滋gDNA;100%(47/47)鼻咽癌和癌旁组织以及72.3%(34/47)的对侧正常鼻咽粘膜组织检出EBV,平均拷贝数分别为6.9×105/滋gDNA、1.5×105/滋gDNA、9.8×103/滋gDNA。正常人鼻咽粘膜、鼻咽癌患者对侧正常鼻咽粘膜之间感染EBV的几率、潜伏感染EBV的数量没有显著性差异(P>0.05);鼻咽癌及其癌旁、对侧正常粘膜组织三者之间,鼻咽癌与癌旁组织之间,癌旁和对侧正常粘膜组织之间EBV拷贝数存在显著性差异(P<0.01)。EBER-1原位分子杂交发现,对侧正常粘膜上皮细胞未检测到EBER-1的表达信号,癌旁靠近癌一侧的部分不典型增生细胞检测到EBER-1弱阳性信号,而在癌组织中的所有癌细胞均有EBER-1强阳性信号。结论无论是鼻咽癌患者还是健康人,EBV在鼻咽组织中的潜伏感染是一种普遍现象,但从鼻咽癌患者对侧正常鼻咽粘膜到癌旁再到癌组织EBV感染的量发生了改变,说明鼻咽上皮细胞中EBV感染量和表达信号的改变很可能是EBV致鼻咽癌的重要环节。

人巨细胞病毒感染与系统性红斑狼疮病情活动性的关联性研究

目的探索人巨细胞病毒(HCMV)感染与系统性红斑狼疮(SLE)病情活动之间的关系。方法采用病毒分离、聚合酶链式反应(PCR)检测HCMVUL54基因和间接免疫荧光试验(IFA)检测HCMVpp65抗原的方法,对49份SLE患者血白细胞标本进行HCMV分离鉴定,并结合临床资料分析HCMV感染与SLE病情活动的相关性。结果49份SLE患者血白细胞标本中,HCMV病毒分离后出现典型细胞病变的有3份,经PCR和IFA联合检测鉴定阳性的有12份,阳性率为24.5%;Logistic回归分析显示,SLE活动期患者的HCMV感染率为38.5%,显著高于SLE非活动期患者8.7%的HCMV感染率(OR=8.7,95%CI:1.4～53.3,P=0.019)。结论HCMV感染与SLE病情活动呈现显著正相关。

流行性感冒病毒的检测及分型方法

流行性感冒病毒是常见的呼吸道病毒,其检测方法主要有4类:病毒培养分离、血清学诊断、病毒抗原检测、病毒核酸检测。随着各项技术的发展,出现了各种快速检测和对流感病毒进行分型的方法,上述方法有各自的优缺点。

人巨细胞病毒蚀斑实验条件的优化及在抗病毒物质活性测定中的应用

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)的蚀斑形成实验最适工作条件,建立稳定易行的HCMV蚀斑技术,用于HC-MV的定量测定及体外抗病毒物质活性测定的研究。方法HCMV病毒悬液接种至人胚成纤维细胞(HF)单层,37℃吸附1h,分别用含0.463‰、0.925‰NaHCO3及0.5%、1%DMSO琼脂糖覆盖,1周后加盖第2层;2周后用0.5%结晶紫染色5min,计数、计算pfu/ml,采用PCR法对蚀斑培养物进行鉴定;分别用患者血清及HCMVAD169株兔免疫血清进行蚀斑抑制实验,计算中和抗体滴度;蚀斑减少实验测定不同浓度更昔洛韦(GCV)的抗HCMV活性。结果HCMV对照孔在5d出斑,蚀斑为圆形、实心、不透明状;两种浓度NaHCO3对蚀斑形成数量、大小有明显影响且病毒滴度差异有显著性(P<0.05)。在含0.463‰NaHCO3培养孔内,出斑时间提前至3d;但不同浓度的DMSO对蚀斑数量、大小以及病毒滴度的影响差异无显著性(P>0.05)。HCMV患者血清及HCMVAD169株兔免疫血清均可以抑制蚀斑形成。利用蚀斑减少实验测定GCV抗HCMV活性,可在7d内获得结果。结论HCMV蚀斑形成实验条件经优化后,可以方便稳定地对HCMV进行定量测定以及抗病毒活性物质的筛选和评价。

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。