利用插入/缺失标记分析我国瓠瓜资源遗传多样性

瓠瓜作为重要的葫芦科作物之一,在我国已有悠久的栽培历史。瓠瓜分子标记研究大大落后于黄瓜、白菜等作物,应用分子标记技术开展瓠瓜种质资源的遗传多样性和亲缘关系研究,对促进瓠瓜重要种质资源的开发和利用具有重要意义。本研究选择96份具有广泛代表性的我国瓠瓜种质材料,利用插入/缺失分子标记技术,研究分析了其遗传多样性和亲缘关系,探讨我国瓠瓜品种间的基因差异和瓠瓜亚种间及亚种内的亲缘关系。结果表明,瓠瓜种质遗传相似系数0.30~1.00,在遗传相似系数0.68处可将96份瓠瓜种质材料分为8类,各种质材料分布较平均;相同瓜型的材料有聚集在一起的趋势,根据瓜型可将这96份瓠瓜种质大致分为3类。

大豆长片段插入/缺失标记的开发与应用

为了开发稳定可靠、操作简便的大豆分子标记,以12份地理来源不同的大豆种质资源为材料,通过基因组10倍深度重测序开发长片段插入/缺失(InDel)标记,并应用2018年黄淮海大豆多点鉴定96份参试品系DNA指纹图谱构建。结果表明,在参试材料中,共检测到插入/缺失片段长度大于20 bp的InDel标记66561个,平均每条染色体InDel标记的数量为3262个;位于内含子的InDel占比12.35%,位于基因上游序列和下游序列的InDel占比分别为25.83%,20.44%,位于基因间隔区的InDel占比34.39%,位于外显子的InDel占比0.19%,位于5′-UTR和3′-UTR的InDel占比分别为0.93%和1.51%;片段长度介于20~40 bp的InDel数量为42453个,41~60 bp为13044个,61~80 bp为5034个,81~100 bp为2285个,大于100 bp为2413个;从检测到的66561个InDel位点中,根据插入/缺失片段长度,在基因组中随机选区160个InDel位点,利用引物设计、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,在55℃的退火温度条件下,开发出32个有且仅有2个等位变异、基于1%琼脂糖凝胶电泳技术易于分辨的长片段插入/缺失标记。应用新开发的32个标记,构建了2018年黄淮海大豆多点鉴定96个参试品系DNA指纹图谱,参试的大豆材料纯度为96.84%,没有同物异名现象发生。研究开发的InDel标记稳定可靠、操作简便,可应用于大豆DNA指纹图谱构建、种子纯度检测等工作。

基于InDels标记的大白菜育种材料的亲缘关系鉴定

采用86对InDels引物对105份大白菜育种材料进行了鉴定,共得到189个多态性位点。每对引物所能检测到的等位基因为2~4个,其中82.6%的引物仅能检测到2个等位基因位点;杂合度指数0~0.1880,平均为0.0511;主要等位基因频率为0.3277~0.9664,平均为0.6638;每对引物的多态性信息含量为0.0629~0.6654,平均为0.3444。94.2%的引物杂合度低于0.1,表明所选材料纯合度较高。采用NTSYS软件对供试材料进行UPGMA聚类分析,当相似系数为0.60时所有试材料分为合抱型(类群Ⅰ)与叠抱型(类群Ⅱ)明显的两个类群。叠抱型所在的类群Ⅱ在相似系数0.63时又进一步分为4个亚群。4个杂种优势非常明显的叠抱型品种的亲本材料分别处于不同的亚群或同一亚群中的不同分支。对双亲标记检测结果的进一步分析后挖掘了一批适宜4个杂交种纯度鉴定的引物,从中筛选了3对适宜4个杂交种纯度鉴定的通用引物。研究结果不仅提供了大白菜杂种优势育种的分子证据,同时也为育种实践中杂交组合的高效选配提供了帮助。

基于HRM技术的大白菜InDel标记高效检测技术构建及其应用

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析技术是基于核酸小片段之间的GC含量差异而导致双链核酸解链温度差异的一门检测技术,更多地被用于特定类型的单碱基突变筛查,很少见用于插入/缺失突变的检测。本研究从前期鉴定的可以有效区分大白菜自交系He102与06-247的593对多态性InDel引物中筛选到271对特异性好、呈共显性分布的InDel引物,采用软件TMUtility_1.5预测了差异目标片段的熔解温度(Tm)值,发现63对标记的Tm差值满足HRM分型的灵敏度(差值绝对值≥0.2℃)要求,进一步采用梯度PCR技术对上述63对引物进行PCR扩增和HRM分型,从中鉴定出20对适宜进行HRM分型的InDel标记。构建了适宜LightScanner-96高分辨率熔解曲线分析仪分析的高效检测体系,并在大白菜种质基因型精准鉴定、杂交种纯度高效鉴定方面得到成功应用。本研究开发的适宜HRM分型的InDel标记还可以作为一种标记储备用于构建遗传连锁图谱和DNA指纹图谱、鉴定杂交种纯度和真实性、关联分析、分子标记辅助育种等。基于此构建的高通量检测方法也为其它动植物材料InDel标记的高通量检测和应用提供借鉴。

籼-粳稻特异插入／缺失分子标记揭示的稻属植物遗传分化

籼-粳分化在亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)的驯化过程中非常重要,但其分化机制仍不清楚.有的学者认为水稻籼-粳分化是亚洲栽培稻在驯化过程中适应不同生境的结果,也有人认为籼-粳分化在水稻的野生祖先种中就已经存在.为了研究普通野生稻的籼-粳分化,并解析稻属(Oryza)植物的籼-粳遗传变异,利用34对籼-粳特异插入/缺失分子标记(InDel)引物,研究了50份典型籼稻(O.sativaL.subsp.Indica Kato)和粳稻(O.sativaL.subsp.japonica Kato)样本以及来源于35个国家的348份稻属其他种材料.结果表明,亚洲栽培稻存在明显的籼-粳分化,普通野生稻复合体(O.rufipogoncomplex)中存在"偏籼"和"偏粳"类型,而稻属的其他种均未出现籼-粳分化,普通野生稻复合体中"偏籼"和"偏粳"类型的地理分布格局与籼稻和粳稻的地理分布格局相吻合.考虑到大部分普通野生稻复合体的样本取自邻近有栽培稻种植的普通野生稻群体,推测得出部分普通野生稻样本中表现出的"偏籼"和"偏粳"类型可能是栽培稻的籼稻品种和粳稻品种在普通野生稻的长期协同进化过程中基因交流的结果.

水稻稻瘟病抗性基因Pi2-InDel标记的开发与评价

通过对水稻抗稻瘟病基因Pi2/9位点上已克隆的功能基因及非功能位点序列的相互对比,鉴定到Pi2特异的核苷酸差异,开发了基于PCR技术的Pi2基因的插入/缺失(insert-deletion,InDel)标记,能有效地将Pi2与其它抗性等位基因及感病等位基因区分开。利用Pi2基因的分离群体进行标记选择与接种鉴定,结果表明Pi2-InDel标记能精确地选择Pi2基因。用Pi2-InDel标记对20份水稻品种和育种亲本进行分子检测,该标记能准确地将抗性基因分离开来。这为筛选水稻稻瘟病抗性种质资源,以及抗性标记辅助抗病育种提供了便利。

开发indel分子标记对人参与西洋参的鉴别研究

人参和西洋参是2种重要的中药材。二者虽然形态相似但药理作用不同。因此,准确地鉴别2种药材对于确保用药及食品安全具有非常重要的意义。该研究根据垂直同源基因中内含子位置相对保守的特点,利用人参的unigene开发了人参和西洋参之间的内含子长度多态性标记。基于人参及西洋参在细胞色素P450和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因中的插入/缺失序列,分别设计了人参和西洋参的特异性引物,并以此建立了用于人参及西洋参鉴别的多重PCR体系。结果表明,该研究建立的多重PCR体系既不需要严格的PCR条件,也无需对反应体系进行优化,可以对人参及西洋参进行有效地区分和鉴定。因此,该研究为人参及西洋参的植物来源鉴定提供了的理想的分子标记系统,也为其他中药材或功能食品的原料来源鉴定提供了方法借鉴。