含小插入片段重组子筛选鉴定方法之探讨

基因工程中，重组ＤＮＡ时，当外源ＤＮＡ很小并与载体相差很大时，其目的重组子的筛选鉴定工作不仅量大，而且常规鉴定方法无法采用。本文针对此类重组子的鉴定方法作了探讨，提出了三级四步筛选鉴定法，即：质粒筛选、重组鉴定、目的重组鉴定和双酶切鉴定。该法不仅有效地解决了国内普通实验条件下含小插入片段重组子的鉴定问题，大大缩小鉴定范围，而且快速省耗的鉴定方法也为ｐＧＥＸ载体系统的更广泛应用提供了新的启示。

猪瘟病毒Thiverval株3′非编码区插入片段对病毒拯救的影响

猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3'-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3'-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFV Thiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3'-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3'-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3'-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。

重组子小插入片段间接内切酶图谱研究

针对重组子中100bp左右的小插入片段与载体不能同时在普通琼脂糖胶上呈现而无法用内切酶图谱鉴定此类重组子的问题，提出了小插入片段间接内切酶图谱，并用普通琼脂糖凝胶电泳研究分析了此类图谱，获得了通过间接内切酶图谱的间接比较来鉴定此类重组子的实验依据，为在国内普通实验室条件下，经济有效地进行小插入片段基因重组研究提供了有益的启示和参考。

金黄色葡萄球菌P83中插入片段ISSA1的特征与分布(英文)

目的 :研究金黄色葡萄球菌P83中插入片段ISSA1的特征与分布。方法 :根据曼尼阿蒂斯方法制备金黄色葡萄球菌P83的染色体DNA ,利用核苷酸序列分析鉴定ISSA1,并通过Southern印迹法对其检测。结果 :ISSA1是属于IS3 0家族的一个新的插入元件 ,并广泛存在于葡萄球菌中。结论 :在细菌中ISSA1能够水平转移。

一种从重组质粒快速提纯DNA插入片段的方法

本文介绍一种从重组质位中快速提纯ＤＮＡ插入片段的方法．质粒ＤＮＡ的制备简单、快速，分离的质粒洲ＤＮＡ可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等．从琼脂糖凝胶中提纯ＤＮＡ注入片段的方法操作简单，回收效率高，提纯的ＤＮＡ片段可用于连接和制备杂交探针等．

大片段DNA插入文库的研究进展

基因组DNA大片段插入文库作为基因组学和基因克隆的技术平台 ,它的发展主要经历了Cosmid文库、YACs文库、BACs文库三个阶段 ,文中对几种文库作了简单的比较和评价 ,对大片段文库的应用作了比较详实的介绍。作者根据自己的建库经验 ,重点介绍了BAC文库的构建。

大豆长片段插入/缺失标记的开发与应用

为了开发稳定可靠、操作简便的大豆分子标记,以12份地理来源不同的大豆种质资源为材料,通过基因组10倍深度重测序开发长片段插入/缺失(InDel)标记,并应用2018年黄淮海大豆多点鉴定96份参试品系DNA指纹图谱构建。结果表明,在参试材料中,共检测到插入/缺失片段长度大于20 bp的InDel标记66561个,平均每条染色体InDel标记的数量为3262个;位于内含子的InDel占比12.35%,位于基因上游序列和下游序列的InDel占比分别为25.83%,20.44%,位于基因间隔区的InDel占比34.39%,位于外显子的InDel占比0.19%,位于5′-UTR和3′-UTR的InDel占比分别为0.93%和1.51%;片段长度介于20~40 bp的InDel数量为42453个,41~60 bp为13044个,61~80 bp为5034个,81~100 bp为2285个,大于100 bp为2413个;从检测到的66561个InDel位点中,根据插入/缺失片段长度,在基因组中随机选区160个InDel位点,利用引物设计、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术,在55℃的退火温度条件下,开发出32个有且仅有2个等位变异、基于1%琼脂糖凝胶电泳技术易于分辨的长片段插入/缺失标记。应用新开发的32个标记,构建了2018年黄淮海大豆多点鉴定96个参试品系DNA指纹图谱,参试的大豆材料纯度为96.84%,没有同物异名现象发生。研究开发的InDel标记稳定可靠、操作简便,可应用于大豆DNA指纹图谱构建、种子纯度检测等工作。

启动子探针型穿梭载体pEQ3的构建及BCG启动子片段的分离

卡介苗(Bacille de Calmette-Guerin,BCG)是世界上应用最广泛的菌苗,而且也是最安全,最稳定的疫苗,还是目前所知最强的免疫佐剂之一。由于在免疫学上具有许多独特优点,如:可研制成活菌苗、提高免疫力、延长保护期、适合表达免疫原性弱的抗原基因、方便、成本低等,使卡介苗在90年代迅速成为基因工程疫苗研究中的热点。 要将BCG改造成为活的重组多价疫苗载体,集佐剂与抗原于一身,就需要在分枝杆菌中建立与E.coil类似的基因转化系统。

新疆军垦型细毛羊基因组BAC文库的构建

选用新疆特有的军垦型细毛羊为材料,构建了含有190464个克隆的全基因组BAC文库.文库的平均插入片段大小为133kb,同时文库92.5%克隆插入片段大于100kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这将满足大多数基因筛选的要求.假定绵羊的基因组含有3×106kb,根据文库的平均插入片段大小为133kb,计算的文库基因组覆盖率为8倍.因此,从文库筛选到目的片段的概率为98.208%.该文库中插入的外源片段来自新疆军垦型细毛羊的基因组,这对于研究新疆军垦型细毛羊的特殊性状的基因与其它绵羊品种和物种之间的差异,以及构建其全基因组物理图谱和基因图谱的完善是非常有利的.

两种Actinobacteria鉴定方法的比较

Actinobacteria classis nov.一般包括具有超过 5 0 % G+ C的 DNA碱基组成的微生物。其中的一些菌种在生物技术和医药方面具有重要的意义。为了分离能产生有用物质的新型微生物 ,我们扩大了分离对象 ,从以前的 Streptomyces和 Streptomyces以外的放线菌扩大到所有的 Actinobacteria。本论文实验中的Actinobacteria将特指那些具有普通细菌形态的高 G+ C含量革兰氏阳性细菌。为了能够将 Actinobacteria和其它革兰氏阳性低 G+ C含量的细菌加以区分 ,我们建立了两种鉴定方法。一种是荧光原位杂交 (FISH)方法 ,它具有准确和直观的优点。另外一种是 PCR方法 ,因在 Actinobacteria2 3S r RNA基因的 domain (螺旋区 5 4a)有 1个大约 10 0个碱基的稳定插入片段 ,通过体外 PCR扩增 2 3S r DNA片段 ,并用琼脂糖电泳分析 ,可以简便地鉴定 Actinobacteria。

石麦15细菌人工染色体文库构建与鉴定

为给小麦功能基因研究提供参考信息,以冬小麦栽培品种石麦15（Triticum aestivum L.）为试材,从暗培养7~10d的黄化幼苗地上部提取高分子量基因组DNA,使用载体pCC1BAC的HindⅢ位点构建了六倍体小麦细菌人工染色体文库。该文库由1 000 000个以上克隆组成,保存在1 020个混合池中,克隆插入片段平均大小为85kb,空载率为2.5%;覆盖小麦基因组5倍以上;挑取7个克隆培养5d后,经HindⅢ完全酶切检测,其指纹图谱稳定一致。石麦15细菌人工染色体文库的构建为小麦基因克隆、调控序列克隆以及比较基因组学研究奠定了基础。

腐食酪螨cDNA表达文库构建及初步鉴定

腐食酪螨（Tyrophagus putrescentiae）是一种常见的世界性储藏物害螨,在温暖潮湿的环境下大量发生在大米、干酪、面粉等储藏物及各类中药材、食用菌中。它不但可以污染破坏储藏物造成严重的经济损失,而且还是一种重要的过敏原,能引起Ⅰ型变态反应性疾病,如过敏性哮喘、过敏性鼻炎和皮炎等。

结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法

通用引物与载体多克隆位点两端序列互补,将目的片段构建入载体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应。用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定。最终以DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段。

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

新疆细毛羊2倍基因组BAC文库PCR筛选系统的构建与使用

本研究所构建的BAC文库覆盖了8倍新疆细毛羊的基因组，平均插入片段的大小为133kb．同时文库92．5％的克隆插入片段大于100kb，而且有部分克隆甚至大于300kb，假定绵羊的基因组含有3×10^6kb，根据文库的平均插入片段大小为133kb，从文库筛选到目的片段的概率为98．208％。为了验证文库有较好的覆盖率．构建了2倍基因组文库PCR筛选系统，并对位于新疆细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73和BM12584个分子标记进行了筛选．得到的平均阳性克隆数为1．5个，从筛选结果来看，这与文库插入片段估计的8倍基因组覆盖率相当接近并且没有偏向，这使得本文库成为研究绵羊的功能基因、位置克隆和完善基因组物理图谱的极为有用的资源。

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能. 方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI 酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行茵落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列. 结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染肺腺癌细胞系的研究

目的 获得稳定表达人呼吸道合胞病毒(h RSV) M2 - 1基因的人肺腺癌细胞系。方法 通过基因重组法构建h RSV M2 - 1基因真核表达载体,用脂质体将其转染人肺腺癌PAa和A5 4 9细胞,经G4 18筛选获得阳性表达细胞株,并用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)和Western Blot进行验证。结果 得到了约6 5 0 bp的基因插入片段,DNA测序表明该基因高度保守。筛选出了稳定高量表达M2 - 1基因的PAa和A5 4 9细胞,并被证实有M2 - 1蛋白表达。结论 获得了稳定表达h RSV M2 - 1蛋白的PAa和A5 4