集胞藻的随机插入诱变和光激活异养突变株的筛选

以４－碱基限制性内切酶部分酶切集胞藻ＰＣＣ６８０３基因文库总质粒ＤＮＡ，并插入卡那霉素抗性基因标记，构建了二级随机插入诱变文库。以该诱变文库总ＤＮＡ转化集胞藻ＰＣＣ６８０３，得到大量有抗性标记基因随机插入的转化子。利用这一方法获得了不能迸行光激活异养生长的突变株，并克隆了抗性标记基因插入部位 ＤＮＡ片段。在持续光照但加 ＤＣＭＵ抑制光合作用的情况下，这些突变株仍然能够利用葡萄糖异养生长，推测突变基因与短时光信号的感应有关。

插入诱变在拟南芥基因克隆中的应用

随着各种基因克隆方法的建立 ,克隆的拟南芥基因越来越多 ,其中转座子标签和T DNA插入诱变克隆的拟南芥基因的数目最多 ,插入诱变已成为克隆和鉴定很多重要植物基因的方法。

插入诱变法应用于植物抗病基因的克隆

插入诱变法(Insertional mutagenesis)克隆基因的原理是将遗传分析清楚的DNA片段引入目的基因,使之产生表型突变,将DNA插入片段作为分子标签,分离其两端目的基因的旁侧序列;反过来再用旁侧序列作为探针分离出野生型基因。目前正在使用两种插入诱变法克隆植物抗病基因。

油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化(ATMT)油菜黑胫病菌L.biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素:潮霉素B浓度为50μg/mL,转化受体(分生孢子)培养时间为15 d(20℃),浓度为2×10^(7-8)孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L.biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。

前病毒插入诱变与白血病发生的研究进展

慢性白血病病毒包括禽白血病增生症病毒、猫白血病病毒、牛白血病病毒、长臂猿白血病病毒和小鼠白血病病毒等,它们的基因组结构完整,具有病毒复制能力,但是序列内不含有癌基因,这是此类病毒的共同特点,其中以小鼠白血病病毒最具代表性。小鼠白血病病毒感染动物后可产生不同类型白血病,潜伏期较长(3～4个月)。小鼠白血病病毒诱发白血病机制较复杂,是一个由多因子参加、多阶段发展的过程。本文就小鼠白血病病毒前病毒插入诱发的淋巴细胞白血病和粒细胞白血病中,原癌基因激活及其作用机制进行综述。

DNA转座子异源活性的大规模调查揭示其功能多样性并扩展基因工程工具箱

自1948年美国科学家Barbara McClintock首次报道转座子以来[1],这类跳跃遗传元件对宿主演化的重要意义逐渐被揭示[2~5]。其中,DNA转座子作为主要类型之一,长期以来备受关注。然而,由于以往多为个案研究,DNA转座子活性的决定因素与进化模式的一般规律尚不清晰。尽管DNA转座子可作为基因工程工具用于插入诱变或转基因载体[6,7],但目前只有Sleeping Beauty(SB)等少数几种转座子得到了开发和广泛应用。因此,系统挖掘具有不同功能特点的转座子工具的工作亟待开展[8]。

血管紧张素转换酶基因插入缺失多态性与原发性高血压患者合并心房颤动的相关性研究

目的 探讨中国河南豫北地区汉族原发性高血压人群血管紧张素转换酶（ACE）基因插入（I）/缺失（D）多态性与心房颤动（房颤） 的关系.方法 采用病例对照法,选择原发性高血压患者803例,分为房颤组405例和窦性心律组398例,采用PCR-RFLP方法进行ACE基因I/D多态性分析.结果 房颤组DD基因型频率明显高于窦性心律组（25.9% vs 13.1%）,ID基因型频率明显低于窦性心律组（38.8% vs 50.3%,P〈0.05）.与携带II＋ID基因型者比较,携带DD基因型高血压患者房颤的风险增加（OR=2.13,95%CI：1.60-3.29,P〈0.05）,携带DD基因型的高血压合并房颤患者左心房内径明显扩大,LVEF明显降低（P〈0.05）.结论 ACE基因I/D多态性与原发性高血压患者房颤的发生存在相关性,DD基因型可能使高血压患者发生房颤的危险增加.

根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌转化系统的建立

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统。这个优化系统的转化条件如下:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH5.6～5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中。

玉米Mu转座因子及其应用

Mu因子是玉米中的一类新型转座因子。本文介绍了Mu因子的发现、分布和类型,对Mu因子的基本遗传特征(突变类型、突变频率、插入专一性、靶位点等)和Mu因子活性的调控(生长发育调控、表观遗传调控)进行了综述,重点论述了Mu活性的调控和应用Mu因子进行玉米插入诱变和基因标签的研究进展。

产蛇孢菌素A禾长蠕孢REMI突变体的制备及其筛选

蛇孢菌素A具有除草、抗菌等广泛的生物活性,在农业领域具有重要的应用价值。本研究采用限制酶介导整合法(REMI)将外源质粒pSH75转化产蛇孢菌素A真菌禾长蠕孢菌获得一系列转化子,进一步采用发酵液抑菌法和稗苗生测法筛选弱毒力菌株,最后用HPLC方法探测弱毒力菌株中蛇孢菌素A产量。试验共获得6株弱毒力菌株,其中B014和B016为蛇孢菌素A合成缺失菌株,H002和B018为蛇孢菌素A毒素合成降低的突变株。为下一步蛇孢菌素A毒素合成相关基因的克隆和蛇孢菌素A基因调控奠定基础。

复旦大学发现机体能量代谢和肥胖调控新机制

复旦大学吴晓晖课题组利用piggy Bac转座子插入突变小鼠资源,发现了G蛋白偶联受体GPR45在肥胖发生发展中的重要作用,并阐明了GPR45调控阿黑皮素原（POMC）表达及机体能量代谢的分子机制。相关成果日前发表于《临床研究杂志》。研究人员利用piggy Bac转座子插入诱变小鼠资源筛选体重和体脂含量异常的基因突变,

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。

固氮作用

893533 固氮螺菌的插入诱变作用[俄]/Borovok,I.A.…//Genetika.-1989,25(1).-36～48[译自 DBA,1989,8(7),89-03916]利用几株固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)评价了受体菌株对

基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用

基因敲除技术是20世纪80年代后半期应用DNA同源重组技术发展起来的,在对基因功能、发育生物学和疾病的研究中发挥了重要作用。直到现在,运用同源重组实现基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍最经典的方法。基因敲除动物模型中应用最广泛的是基因敲除小鼠模型。综述目前国内外实现基因敲除的几种重要方法以及利用同源重组实现的基因敲除技术在雌性小鼠生殖系统研究中的应用。这些应用主要包括研究性激素对生殖器官及激素依赖性疾病的影响、细胞分泌因子在发育期调控生殖器官组织的机制及胚胎形成后的性腺发育与成熟缺陷等。

中国人血管紧张素转换酶基因I/D多态性的研究

目的:探讨中国人血管紧张素转换酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)基因多态性分布。方法:利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)方法检测141例正常人和200例高血压患者的ACE基因型,同时检测其血清ACE水平,并对55例未服用过降压药物的高血压患者分别于治疗前及口服卡托普利25mg1h后测定其血清ACE活性的变化。结果:高血压组的I等位基因频率(0.65)显著高于正常对照组(0.57)(P<0.05)。DD型患者ACE活性最高,临床合并症多,预后差。未发现基因型与血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensinconvertingenzymein-hibitor,ACEI)疗效有关。结论:①ACEI等位基因可能为中国人原发性高血压的危险因子。②ACE基因缺失多态性与血清ACE活性有关,并增加高血压合并靶器官损害的危险。③ACE基因多态性与ACEI疗效无关。

血管紧张素I转换酶基因插入/缺失遗传变异与中国人群2型糖尿病肾病发病风险的Meta分析

目的综合评估血管紧张素I转换酶(ACE)插入/缺失(I/D)遗传变异与中国人群2型糖尿病肾病(T2DN)发病风险的关系。方法应用中国知网(CNKI)及万方数据知识服务平台检索相关文献,截止日期2016年6月1日。运用Review Manager 5.0研究数据进行统计分析,以合并OR值及相应95%置信区间(95%CI)评估ACE基因I/D多态与T2DN的发病风险。结果依据纳入、排除标准,共29篇文献4 357例研究对象,包括2 208例T2DN患者和2 149例2型糖尿病且无DN者纳入本研究。Meta分析显示,与ACE基因I/D多态I等位基因相比,D等位基因可显著增加T2DM患者发生DN的风险,OR值及相应95%CI为1.44(1.25,1.66);基因型分析显示,在显性和隐性遗传模型下,ACE基因I/D多态位点与中国人群DN发病风险显著相关,相对发病风险的OR及相应95%CI为1.42(1.15,1.76)和1.75(1.46,2.10)。Begg′s检验显示,所纳入研究数据不存在明显发表偏倚。结论 ACE基因I/D多态性与T2DN发病风险密切相关,D等位基因可能是2型糖尿病患者发生DN的危险遗传因素。

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析

目的 筛选适合于宫颈癌治疗性疫苗研制的人乳头瘤病毒 1 6型 (HPV1 6)E6和E7突变基因。方法 采用定点诱变技术对E6和E7基因进行改造 ,得到几种E6和E7基因的突变体 ;构建成表达野生型和突变型E6与E7的重组痘苗病毒 ,对这些重组痘苗病毒表达的E6和E7蛋白的稳定性及其免疫原性进行了比较研究。结果 E6蛋白第 50位氨基酸的突变、E7蛋白第 2 4和 2 6位氨基酸的突变都不影响蛋白的稳定性和抗原性 ,但E7蛋白第 91位氨基酸的突变使E7蛋白的稳定性和抗原性大大减弱。结论 证实了E7蛋白C 末端的锌指结构对E7蛋白结构的完整性和稳定性是非常重要的。

表达野生型和突变型HPV16-E7重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的 选出适合于治疗性疫苗研制的HPV16E7突变基因。方法 对表达野生型和突变型E7蛋白的重组痘苗病毒所诱发的细胞免疫反应和抗肿瘤活性进行比较研究。结果 表达突变型ME7 1(2 4G2 6G)的重组痘苗病毒VmE7 1与表达野生型E7的VwE7相同 ,可诱发特异性抗体和CTL的产生 ,明显推迟成瘤时间并且保护部分小鼠抵抗肿瘤细胞的攻击 ;而表达突变型ME7 2(2 4G2 6G91G)的重组痘苗病毒VmE7 2免疫小鼠后难以有效的激发细胞免疫反应 ,在抗肿瘤移植实验中也不具明显的免疫保护作用。结论 E7突变基因ME7 1可作为候选基因用于HPV16治疗性疫苗的研制。

鱼类活性DNA转座子的发掘与应用概况

转座子(transposon)是基因组上的一段一定长度的DNA序列,能在自身编码的转座酶作用下,以"剪切-粘贴"的方式在基因组中进行高效转座。基于转座子的插入诱变策略,在包括鱼类在内的脊椎动物重要性状主控基因的筛选、功能解释以及基因组学研究方面有着重要的研究前景。长期以来,DNA转座系统在脊椎动物中的构建和应用都是空白,直到近十来年,随着青鳉Tol2、鲑SB、鲽Passport以及金鱼Tgf2等几例鱼类活性转座子的发现,开启了利用转座子工具在斑马鱼、小鼠等脊椎动物进行转基因和基因组插入诱变研究的新领域。介绍了鱼类DNA转座子的类型、结构特征及应用方面的最新研究进展,探讨了转座子在养殖鱼类重要性状主控基因的发掘、功能解释以及基因组学研究的可行性。