山羊支原体山羊肺炎亚种重组酶聚合酶扩增技术的建立

为检测山羊传染性胸膜肺炎,选择Mccp-arcA假基因作为靶基因,用Primer 3 plus设计筛选生物素标记的特异引物和荧光素标记的探针,将双标记扩增产物结合到核酸检测试纸条,通过优化反应温度和时间,建立了一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的重组酶聚合酶扩增技术,对其灵敏度、重复性、准确性和特异性进行了试验,并初步用于临床样品的检测。结果显示,山羊传染性胸膜肺炎核酸阳性样品能够在核酸检测试纸条上显示阳性条带,阴性样品无条带。试验具有良好的重复性和敏感性(达到10 copies/μL)。用建立的重组酶聚合酶扩增技术与普通PCR方法同时检测疑似山羊传染性胸膜肺炎8份样品,结果均为3份阳性和5份阴性,符合率100%。该检测方法适用于山羊传染性胸膜肺炎的快速诊断,为Mccp的快速检测提供了新的技术。

山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶基因的克隆表达及其编码氨基酸的生物学分析

旨在获得山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)的蛋白表达产物,分析其编码氨基酸的生物学特性,为进一步研究LDH蛋白的功能奠定基础。试验完成了LDH基因的克隆和密码子改造,成功将LDH基因中473、761、779 nt处的A突变为G,使改造后的LDH基因能在大肠埃希氏菌Rosetta中正确表达。SDS-PAGE电泳结果显示,IPTG诱导目的蛋白表达后获得一条大小约34 ku的蛋白条带,Western blot结果表明获得的原核表达产物可与抗6×His tag的单克隆抗体发生特异性反应,研究采用DNAStar Protean模块分析了LDH的二级结构、蛋白骨架柔性区域和可能的B细胞抗原优势表位,为进一步研究其功能奠定了基础。

基于0507蛋白的山羊支原体山羊肺炎亚种抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)抗体检测方法,对Mccp的0507基因进行克隆与载体构建,通过原核表达技术制备重组0507蛋白,建立Mccp抗体间接ELISA检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性与重复性,并对临床收集的血清样品进行检测。结果显示,重组0507蛋白大小为39 ku,Western blot证明重组0507蛋白具有良好的反应原性;建立的ELISA检测方法抗原包被量为3μg/mL,血清稀释倍数为1∶200,酶标二抗稀释倍数为1∶2500,阴阳临界值为0.221。用该方法对山羊流产衣原体、立克次氏体与牛支原体的阳性血清进行检测,结果均为阴性;Mccp阳性血清最大稀释倍数为1024倍;批内、批间变异系数均小于10%。对陕西省部分羊场收集到的282份血清进行检测,Mccp阳性率为13.1%。该研究建立了一种检测Mccp抗体间接ELISA检测方法,为Mccp的实验室诊断和流行病学调查提供了技术支持。

一株山羊支原体山羊肺炎亚种的分离鉴定与分子特征

从送检的山羊肺炎肺脏中成功分离到一株支原体,经过3次克隆纯化后进行生化试验、电镜观察、PCR及酶切、基因特征鉴定,结果显示分离物SD3属于山羊支原体山羊肺炎亚种成员。将培养物经气管接种2只山羊可引起1只山羊典型发病,体温升高至41.5℃,IgG和IgM抗体效价明显升高,其中IgG抗体变化与临床表现基本同步。剖检发现肺脏发生严重病变,并从中再次分离到该病原体。

山羊支原体山羊肺炎亚种湖北株的鉴定及其外膜蛋白的免疫原性研究

从湖北某地山羊肺脏中分离支原体,经多次克隆纯化后进行生化试验、显微镜观察、PCR及酶切分析、基因特征鉴定以及用动物致病性试验对该菌株进行了鉴定,命名为GH2,进一步通过免疫印迹对GH2株外膜蛋白及GH2株全菌蛋白免疫原性进行分析,并用抗Y98血清和抗PG3血清进行比较,筛选GH2株特异性的外膜蛋白,结果表明GH2株为山羊支原体山羊肺炎亚种,存在于GH2外膜蛋白中的相对分子质量大约为60和49.7ku的蛋白可能是其主要的免疫原性蛋白,也是GH2株区别于丝状支原体山羊亚种标准株PG3和绵羊肺炎支原体标准株的主要特异性抗原。这一结果为山羊支原体山羊肺炎亚种的诊断和疫苗研制提供了良好的理论基础。

从山羊中检测山羊支原体山羊肺炎亚种

山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasmacapricolumsub—sp．capripneumonia，Mccp）最早由MacOwan和Minette于1976年分离，是引起山羊传染性胸膜肺炎（Contagiouscap—rineplemopneumonia，CCPP）的病原体。CCPP是山羊的一种急性或慢性呼吸道传染病，以纤维素性胸膜怖炎为主要特征，被感染羊群无年龄和性别差异，发病率和死亡率都很高。该病的发生最早可追溯到1873年的阿尔及利亚，现广泛流行于非洲和亚洲养羊国家，危害极大，被世界动物卫牛组织（OIE）列入重要疾病名录。

一种山羊支原体山羊肺炎亚种多重抗原肽的小鼠免疫试验

旨在构建一种由山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum Subsp.capripneumoniae,Mccp)六个B细胞表位和三个T细胞表位组成的多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),将其在大肠杆菌中表达后免疫小鼠,评估其体液免疫和细胞免疫。分别用MAP、单个B细胞表位及全菌超破抗原作为抗原,检测免疫小鼠抗体水平,结果显示三种抗原均能和小鼠免疫血清发生很好的反应(P<0.01)。体外代谢抑制试验显示,1∶64倍稀释的免疫小鼠血清可以有效抑制Mccp的生长。淋巴细胞增殖试验显示,当用单个T细胞表位及Mccp超破抗原分别刺激免疫小鼠的淋巴细胞时均产生明显的增殖现象(P<0.01)。细胞因子检测结果显示,免疫小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10产量明显升高(P<0.001),而IL-12产量明显下降(P<0.001)。数据显示,构建的MAP能够引起小鼠的免疫反应,这一结果为由Mccp引起的山羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了一定的基础。

青海省山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测

[目的]调查山羊传染性胸膜肺炎在青海省的流行状况。[方法]利用山羊支原体山羊肺炎亚种抗体检测间接血凝试剂盒对青海各地区的208份山羊血清进行检测。[结果]山羊血清阳性率为16.3%,不同地区山羊的阳性率范围为6.7%～24.3%。[结论]青海地区的山羊支原体山羊肺炎亚种的感染率较高,应该加强对该病的防控。

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。

山羊支原体山羊肺炎亚种单克隆抗体的制备及抗体结合抗原表位的筛选

本研究旨在制备山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)的单克隆抗体并筛选与抗体结合的抗原表位。试验用甲醛灭活的Mccp免疫BALB/c小鼠,运用传统的细胞融合技术进行融合获得杂交瘤细胞,亚克隆,制备单克隆抗体腹水,采用酶联免疫技术(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)技术鉴定单克隆抗体的特异性及胶内酶切鉴定与抗体结合的抗原表位。最终成功筛选获得5株单克隆抗体,鉴定到3个与抗体结合的抗原表位,为下一步科学研究提供了初步且可靠的试验基础。

羊支原体山羊肺炎亚种在两种培养基上的生长特性比较

通过比较山羊支原体肺炎亚种在两种不同培养基上的繁殖情况,筛选出成本低、生长迅速、产量高的适合疫苗制备的培养基。选用山羊支原体肺炎亚种F38株,分别接种到改良的Thiaucourt’s肉汤(MTB)培养基和含5%马血清的改良培养基(HF3)上,在144h内检测菌落形成单位(colony forming units,CFU)、颜色变化单位(color change units,CCU)、菌体蛋白浓度变化情况,并绘制出生长曲线图。山羊支原体肺炎亚种F38株在HF3培养基中CCU计数和CFU计数均高于MTB培养基上的计数,但蛋白浓度略低于MTB培养基培养情况,HF3培养基较MTB具有更好的培养效果。

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和山羊支原体山羊肺炎亚种多重PCR检测方法的建立

为同时快速检测绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)和山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),本研究根据Mo的P80基因,Mmc的MLC_1760和Mccp的arcA基因序列,设计合成了3对特异性引物,建立了同时检测Mo、Mmc和Mccp的多重PCR方法。该方法可以同时扩增出Mo、Mmc和Mccp的特异性片段,而对大肠杆菌、巴氏杆菌、羊传染性脓疱病毒等常见羊病病原无交叉反应,对Mo、Mmc和Mccp的最低检出量分别为3.62×10~4拷贝/μL、4.03×10~5拷贝/μL和6.78×10~5拷贝/μL。应用该方法对75份临床样品进行检测,结果与单一PCR检测结果一致。对32份临床样品同时用该多重PCR方法与分离鉴定法进行检测,结果显示,两种方法对Mo、Mmc、Mccp的检测符合率分别为87.5%、100%、100%。本研究建立的多重PCR方法特异性强、敏感性较高,适用于Mo、Mmc和Mccp临床快速检测及流行病学调查。

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法,本研究采用2对特异性引物,对退火温度和引物浓度比进行了优化,成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重PCR方法。结果显示,该方法具有很好的特异性,仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增,而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增;该方法对两种病原的检测限分别为32pg和50pg,与单独PCR相同;26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23.1%,多杀性巴氏杆菌的检出率为26.9%。所建立的双重PCR具有特异性好、灵敏度高的特点,为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。

山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株的分离鉴定

为获得山羊传染性胸膜肺炎病原野毒株,采集陕西杨凌某羊场疑似患山羊传染性胸膜肺炎山羊的鼻分泌物,进行PCR检测,病原分离培养,菌落形态观察,生化培养试验鉴定,PCR鉴定,基因序列测定分析,动物回归试验。结果显示,PCR检测鼻液分泌物呈山羊支原体山羊肺炎亚种阳性;菌落呈现中心脐、边缘光滑、油煎蛋状样;能发酵葡萄糖、不水解精氨酸、不分解尿素、能还原四唑氮、膜斑试验阴性、可液化马血清、消化酪蛋白,对洋地黄皂苷敏感;基因测序结果显示与GenBank中已收录的山羊支原体山羊肺炎亚种基因同源性为99.8%;动物回归试验结果显示,该菌株对山羊造成了严重的胸膜肺炎,具有致病性。结果表明,成功分离出1株山羊支原体山羊肺炎亚种野毒株。

山羊支原体山羊肺炎亚种0297基因的序列分析及原核表达

山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)病原为山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp),该病是一种呼吸道传染病,给山羊养殖业带来了严重损失。为了能对该病进行更好的诊断和预防,从临床发生CCPP的山羊肺脏组织中提取Mccp 0297基因,并且在测定其序列的基础上,将该序列与GenBank中已收录的其他9株Mccp的0297基因序列进行比对分析,并对该序列所编码的蛋白进行结构预测及原核表达。结果表明,PCR扩增到全长为717 bp的Mccp 0297基因,其核苷酸序列与其他9株Mccp的0297基因序列的同源性在99%以上;该序列编码的P0297蛋白具有很强的亲水性并可能存在多处的抗原表位分布,原核表达大小约为43 ku的P0297蛋白。

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601生长曲线与pH值的测定

为了研究山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601株在Thiaucourt肉汤培养基中的生长及繁殖特性。利用活菌计数方法对其在不同培养阶段的生长滴度及pH值进行了测定，并绘制了生长曲线。结果表明，传代稳定的M1601在Thiaucourt肉汤培养基中培养6～60h为对数生长期．pH值逐渐下降：培养60～72h进入稳定期．pH值降为6．27．培养72h进入衰亡期。这为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究和疫苗生产工艺研究提供了参考数据，以便在生产上更合理地应用其生长规律。

基于可见光测定的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原定量

山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)的病原,可用灭活疫苗和荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)间接血凝试剂进行预防和血清学检测,但高昂的培养成本和复杂的抗原定量一直困扰着生产人员。为解决生产实际中出现的这些问题,本研究基于Mccp代谢组学的前期理论基础,通过改变初始pH值的方法,初步筛选出初始p H值为7.8的可以同时提高2种抗原产量的糖发酵培养基。利用紫外可吸收光谱可识别酚红,以及十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)可与阴离子荚膜多糖结合的理论依据,建立了利用紫外光谱分析Mccp达到的培养阶段,以及利用CTAB沉淀法相对定量发酵液荚膜多糖抗原产量的方法。通过紫外图谱观察的方法可对应Mccp生长曲线进行指导生产,大大节省传统颜色变化单位(color change unit,CCU)法的监测时间,提高了原肉眼观察方法的精确度。建立的CTAB沉淀法可在5 h内完成对CPS含量的监测,与传统的差值法相比大大缩短了时间,并且其准确度得到苯酚-硫酸法的验证。本研究优化的一种培养基和建立的两种相关性比较方法,可有效降低Mccp生产成本,提高生产效率,这些方法已在本实验室的研究阶段得到应用,为进一步改进CCPP灭活疫苗和荚膜多糖的生产工艺以及快速定量提供了实验数据。

山羊支原体山羊肺炎亚种甘肃株的分离及鉴定

2007年甘肃某地羊场山羊发生以呼吸困难、咳嗽和胸膜肺炎为特征的呼吸道传染病,经临床诊断为羊支原体性肺炎。用改良的Thiaucourt's培养基对病山羊的肺组织进行病原分离,成功分离到1株支原体M1601,经菌落形态观察、生化试验、PCR鉴定、以16S rRNA基因序列构建的分子进化树分析和动物致病性试验,证明该分离株属于山羊支原体山羊肺炎亚种。

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。

山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。