疫苗生产过程中预防支原体污染的方法

兽用疫苗的生产过程通常会涉及细胞培养,而在细胞培养过程中非常容易被支原体污染,影响细胞的正常形态和遗传,进而对疫苗制品的质量与安全造成严重的负面影响,破坏疫苗的正常免疫效力,甚至会给动物造成严重的危害。笔者简单阐述了在疫苗生产过程中的重点检测目标、疫苗生产中常见的污染物、支原体常用的检测方法,同时还对有效预防支原体污染提出了几点建议,以供相关人员参考。

兽用疫苗生产中支原体污染检测及预防

在兽用疫苗生产的过程中,特别是对细胞培养过程中,极易被支原体污染,严重地影响了疫苗的质量及安全,对于普通疫苗和细胞生产活毒疫苗的污染,会给疫苗生产商或使用不合格疫苗的养殖户带来极大的经济损失,同时也不利于畜禽疾病防控工作的顺利开展。其中支原体是疫苗生产过程中比较常见的微生物,而造成支原体污染的原因也较多.

生物制品中支原体污染的快速检测

用两步ＰＣＲ法（ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）及ＤＮＡ荧光染色技术（ＨｏｅｃｈｓｔＳｔａｉｎｉｎｇ），检测了８１份不同来源和批号的疫苗及一些实验用细胞株中的支原体，并对检测结果做了比较。ＰＣＲ阳性检出率为３８．３％，Ｈｏｅｃｈｓｔ阳性检出率为１９％。这些结果表明ＰＣＲ法较Ｈｏｅｃｈｓｔ染色法更敏感。

应用SYBR Green Real Time PCR技术检测细胞培养物中支原体污染

根据常见支原体23S rRNA的保守区域基因序列,设计通用引物,应用SYBR Green Real Time PCR技术,研究建立了细胞培养物中支原体污染的快速检测方法。该方法能检测到污染细胞培养物的6种常见的支原体,敏感度达4.2×10-2pg/mL模式株的DNA。

支原体污染的检测及鉴定方法研究进展

自1956年国外学者第一次检测到细胞培养物中存在支原体污染以来,这个世界性问题持续了半个多世纪。对于生物制品中支原体污染的检测方法多种多样,但尚无统一的内控标准,而建立一种快速、准确的方法用于支原体污染的检测,可以有效地减少和预防支原体污染,从而提高生物制品的纯净性。本文对支原体污染的几种常见检测及鉴定方法进行综述,包括DNA荧光染色法、PCR、IFA与ELISA等,以期为支原体污染的检测及鉴定研究提供参考。

羊驼黑色素细胞培养中支原体污染初探

为了研究山西农业大学生命科学学院细胞工程实验室(本实验室)培养的羊驼黑色素细胞是否存在支原体污染,试验首先通过文献数据库中支原体污染相关文献检索,了解支原体污染在目前科研领域中的影响,然后采用细胞培养法、光学显微镜观察检测实验室冻存的部分羊驼黑色素细胞的生长状态。结果表明:文献报道中支原体污染情况比较严重,其中与细胞培养相关的占14%~20%;本实验室冻存的细胞中部分细胞确实存在支原体污染。分析主要原因是实验人员操作不当、自身携带的人源支原体掉入培养液中引起污染。

山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的去除及预防平台建立

为了研究如何有效清除和避免细胞培养过程中支原体的污染,建立细胞培养过程中支原体预防和清除平台,试验以山羊耳缘成纤维细胞（GEFs）为研究对象,通过RT-PCR方法检测细胞是否存在支原体污染;然后对检测出的阳性细胞株使用25.0μg/m L支原体抗生素（plasmocin）处理2周,再降低浓度为12.5μg/m L处理1周,最后再通过RT-PCR方法检测细胞中是否存在支原体污染。结果表明：用25.0μg/m L的plasmocin处理阳性细胞株2周后,支原体阳性条带明显减弱,但并未完全清除;降低浓度为12.5μg/m L继续处理1周,RT-PCR检测显示支原体条带呈阴性,即支原体已被消除。说明运用plasmocin可对细胞支原体污染进行有效治疗,成功建立了山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的预防和去除平台。

PCR和分离培养检测细胞培养支原体污染的比较

目的：检测细胞培养中支原体的污染，建立支原体通用的ＰＣＲ方法。方法：根据已出版的序列设计并合成一对支原体（柔膜体纲）１６ＳｒＲＮＡ基因组特异引物。对实验室所存的１２种支原体、大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞进行了ＰＣＲ扩增。以ＰＣＲ与分离培养比较检测了３３份细胞培养标本。结果：１２种支原体均出现了约６２０ｂｐ左右的特异性扩增带，敏感性为１００～１０００个支原体细胞，且常见的６种细胞培养污染支原体的扩增片段均能被ＨｉｎｄⅢ切成２８０与３４０ｂｐ左右的２条带。理论上推测这对引物可扩增所有支原体１６ＳｒＤＮＡ。但对大肠杆菌、变形杆菌及无支原体污染的组织培养细胞等未见有扩增带出现。在对３３份细胞培养标本的检测中，除ＰＣＲ和分离培养同时检出２份阳性外，前方法还另检出阳性３份。５份ＰＣＲ扩增物均被ＨｉｎｄⅢ切出２条带。结论：ＰＣＲ较分离培养敏感性高，可提高细胞培养污染支原体的检出率，防止出现假阴性结果；如做好质量控制，对于一般实验室检测细胞培养支原体污染。

应用聚合酶链式反应检测细胞培养物和细胞培养用小牛血清支原体污染

支原体污染是细胞培养中普遍存在的突出问题,直接影响细胞培养的成败以及以细胞培养为基础的科学实验结果的准确性。本试验用聚合酶链式反应(套式PCR)对实验室中生长不良的3种细胞系、11种细胞培养用小牛血清进行了检测。结果显示,3种细胞系的第一次PCR扩增结果为全部为阳性,检出率为100%;11种细胞培养用小牛血清第一次PCR扩增后8种样品为阳性,对第一次PCR扩增为阴性的血清样品进行第二次PCR扩增结果全部为阳性,检出率100%。传统的支原体检测繁琐、费时、周期长而受到限制,本试验使用的套式PCR法为细胞培养工作中检测支原体污染提供了一种敏感、快速、特异的方法。

兽用生物制品的支原体污染检验及注意事项

制备支原体污染检验培养基所使用原材料水、血清、无机盐类、乳蛋白水解物、琼脂的质量要求 ,制备培养基方法 ,检验操作及检验中注意事项。

细胞培养中支原体污染的PCR检测

根据支原体16s rDNA序列,选择RemyTeyssou设计的三条寡核苷酸链,组成两套引物:P_(1-2a)能检测出细胞培养中常见的各种支原体,P_(1-2b)能检出无胆甾原体。反应可检出体系中10CFV的菌体。此法先用于对实验室人为污染支原体Vero细胞的检测,后与DNA 染色法和培养法比较,检测了49份生物样品,其中24份传代细胞,PCR检测的阳性率为58％,DNA染色法为42％,培养法为33％;三者的灵敏性比较,PCR可检出10^(-3)稀释度的阳性样品,高于其他两种方法。此PCR方法快速、灵敏、特异,适用于细胞培养中支原体污染的检测。

去除传代细胞中支原体污染的研究

支原体污染人和动物细胞系一直是组织培养中常见而又难以解决的问题,各实验室污染率不等,高的可达92％。

贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究

支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物，约有30．3％～50．5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括：所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达10^7个/ml,而培养的细胞看起来很正常．在肉眼观察或普通光学显微镜下观察。受污染的细胞可无明显变化日。

应用电镜技术快速检测培养细胞中的支原体污染

应用电镜技术可快速准确地检测培养细胞中的支原体污染。通过高速离心浓缩样品,负染色后电镜观察,可在30min内做出判定,方法快速、简便、准确。

生物制品中的支原体污染

支原体（Myeoplasma）是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0．2um）并独立生活的微生物，是生物制品细胞培养中较常见的污染物。目前，细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染已成为一个世界性问题。据报道，目前世界上有30％．50％的细胞系（株）已受支原体污染。

生物制品生产过程中支原体污染的预防和清除

在生物制品中,组织活疫苗和细胞苗都可能由于种种原因受到支原体的污染,尤其是细胞苗更容易受到污染。支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰正常生产的污染物，约有30％～50％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，

细胞培养中支原体污染的检测和去除

细胞培养过程中的支原体污染相当普遍。如何快速、简便地检测支原体,并且采取有效措施去除支原体一直是细胞工作者们亟待解决的难题。支原体检测方法有培养法、DNA荧光染色法、单克隆抗体免疫荧光法、生化法、DNA探针杂交法、PCR法。支原体去除方法有药物法、免疫法、稀释法、加热法。本文就近年来有关支原体的检测及去除作一综述。