猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

自噬在α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化中的作用

目的:探讨自噬在α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化中的作用。方法:采用Western blot检测BEP2D细胞、α粒子作用BEP2D后的第24代细胞RH24以及α粒子作用BEP2D后的恶性转化细胞BERP35T-1(经鉴定为肺鳞癌细胞)内自噬相关蛋白LC3B-II、LC3B-I和P62的表达,透射电镜观察细胞内单位面积自噬小体的数量。分别用40和60μmol/L自噬抑制剂氯喹(CQ)及25 pmol/L自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)作用BERP35T-1细胞,采用Western blot法检测细胞内LC3B和P62蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞的存活率,Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭数,划痕愈合实验检测细胞划痕闭合率。结果:与BEP2D细胞相比,RH24和BERP35T-1细胞内LC3B-II/I蛋白比值增高(P<0.05或P<0.01),P62蛋白表达降低,自噬小体数量增多(P<0.01)。40和60μmol/L的CQ分别作用BERP35T-1细胞48 h后,细胞内LC3B-II/I蛋白比值和P62蛋白表达水平均升高,细胞的存活率、侵袭数和划痕闭合率均降低(均为P<0.01);25 pmol/L的Rapa作用BERP35T-1细胞48 h后,细胞内LC3B-II/I蛋白比值升高,P62蛋白表达减弱,细胞的存活率、侵袭数和划痕闭合率均升高(P<0.05或P<0.01)。结论:在α粒子辐射诱发BEP2D细胞恶性转化过程中,细胞自噬增强,可能由此提高细胞的增殖、侵袭和迁移能力,从而促进细胞恶性转化。

甘草酸抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨甘草酸对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响,分析其机制是否与内源性酪氨酸激酶2(JAK2)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路有关。方法:将HBE细胞分为对照组、感染组(RSV组)、低剂量甘草酸组(RSV+L-甘草酸组)、中剂量甘草酸组(RSV+M-甘草酸组)、高剂量甘草酸组(RSV+H-甘草酸组)、RSV+Colivelin组、RSV+H-甘草酸+SD-1029组。对照组细胞不经任何处理;RSV组用含0.0001 PFU/mL的RSV病毒溶液培养细胞2h,再更换为正常培养液培养24h;RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组和RSV+H-甘草酸组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用30、60、120μg/mL甘草酸处理的培养基培养的细胞;RSV+Colivelin组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用含有浓度为0.5μmoL/L JAK2/STAT3信号通路激活剂Colivelin处理的培养基培养细胞;RSV+H-甘草酸+SD-1029组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用120μg/mL甘草酸和10μmoL/L JAK2/STAT3信号通路抑制剂SD-1029共同处理的培养基培养细胞。24h后收集细胞,CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α水平;western blot检测细胞中Bax、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况。结果:与对照组比较,RSV组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05);与RSV组比较,RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组、RSV+H-甘草酸组、RSV+Colivelin组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.05);与RSV+H-甘草酸组比较,RSV+H-甘草酸+SD-1029组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论:甘草酸可能通过激活JAK2/STAT3信号通路,促进RSV感染的支气管上皮细胞增殖,抑制RSV感染的支气管上皮细胞的凋亡。

PM_(2.5)有机提取物经由铁死亡诱导人支气管上皮细胞损伤的研究

目的探讨细颗粒物(PM_(2.5))有机提取物能否诱导人支气管上皮细胞铁死亡。方法通过索氏提取法提取PM_(2.5)中有机物作为受试物,使用BEAS-2B细胞,以0.1%DMSO溶液作为溶剂对照,染毒于不同剂量(2.5、5、10和20μg/mL)的PM_(2.5)有机提取物构建细胞染毒模型;使用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)构建铁死亡干预模型。通过吸光度法检测PM_(2.5)有机提取物染毒后BEAS-2B细胞存活率、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)浓度;通过荧光法检测细胞内Fe2+含量、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和脂质过氧化物(lipid peroxidation,LPO)含量;通过qRT-PCR方法检测铁死亡相关基因(如GPX4、SLC7A11、ACSL4、FTL和TFRC等)表达。结果与对照组相比,PM_(2.5)有机提取物染毒24 h后,当染毒剂量为10μg/mL时,细胞内Fe2+含量、ROS含量、LPO含量和MDA浓度均出现显著上升;而GSH浓度出现显著下降;qRT-PCR结果显示,细胞暴露于20μg/mL PM_(2.5)有机提取物时,细胞内铁死亡相关基因GPX4显著下调,SLC7A11、ACSL4、FTL和TFRC出现显著性上调。干预实验中,使用铁死亡特异性抑制剂Fer-1干预后上述变化得到明显改善。结论PM_(2.5)有机提取物可能通过诱导细胞铁死亡导致呼吸系统细胞损伤,进而对肺组织产生潜在健康影响。

桑白皮汤含药血清调控人支气管上皮细胞黏液高分泌的机制研究

目的探究桑白皮汤调控人支气管上皮细胞黏液高分泌的机制。方法制备桑白皮汤含药血清和乙酰半胱氨酸溶液,采用15%香烟溶液和20 ng/mL脂多糖溶液对人支气管上皮细胞进行气道黏液高分泌造模,按照药物干预分为桑白皮汤组、乙酰半胱氨酸组、空白组及模型组,采用CCK-8法检测人支气管上皮细胞活性、电子显微镜下观察细胞形态及WB法检测数据挖掘中预测的白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达。结果实验显示,模型组与空白组对比,细胞活性降低,桑白皮汤组与模型组对比,细胞活性升高(P<0.05)。模型组与空白组对比,炎症细胞因子IL-1β、TNF-α蛋白表达明显增多(P<0.05),表明气道黏液高分泌造模成功。桑白皮汤组、乙酰半胱氨酸组与模型组对比,IL-1β、TNF-α蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论桑白皮汤含药血清可显著降低IL-1β、TNF-α蛋白表达,其治疗气道黏液高分泌的机制与调控炎症因子IL-1β、TNF-α有关。

FGF23对支气管上皮细胞生长、免疫平衡和上皮间充质转化的影响

目的探究成纤维细胞生长因子23(FGF23)对支气管上皮细胞16HBE生长、免疫平衡和上皮间充质转化(EMT)的影响。方法使用Lipofectamine 3000转染试剂对16HBE细胞分别转染NC-shRNA或FGF23-shRNA。转染后,使用10 ng/mL TGF-β1处理细胞48 h。16HBE细胞分为对照组、NC-shRNA组、FGF23-shRNA组、TGF-β1组、NC-shRNA+TGF-β1组和FGF23-shRNA+TGF-β1组。通过CCK-8法检测细胞增殖。使用ELISA试剂盒检测16HBE细胞上清液中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的水平。通过qRT-PCR、Western blot或免疫荧光染色检测16HBE细胞中FGF23、Klotho、FGFR4、E-cadherin、α-SMA和N-cadherin的mRNA或蛋白表达水平。结果与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的OD 450nm值降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的IFN-γ和IL-10的水平升高,而IL-4和IL-17降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的E-cadherin蛋白表达水平升高,而α-SMA降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的E-cadherin相对荧光强度升高,而N-cadherin降低(P<0.05)。与TGF-β1组相比,FGF23-shRNA+TGF-β1组的FGF23和FGFR4的mRNA和蛋白表达水平均降低,而Klotho均升高(P<0.05)。结论下调FGF23抑制了TGF-β1诱导的16HBE细胞的生长和EMT过程,并纠正了Th1/Th2和Treg/Th17的失衡,FGF23-Klotho-FGFR4信号可能是哮喘治疗的一种分子靶标。

克洛己新干混悬剂对LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用

目的 探讨克洛己新干混悬剂对脂多糖(LPS)诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用及其潜在机制。方法 将处于对数生长期的人支气管上皮细胞系BEAS-2B分为对照组(无干预)、LPS组(给予25μg/ml LPS)、克洛己新干混悬剂组(给予1 mg/ml克洛己新干混悬剂)和LPS+克洛己新干混悬剂组(分别给予25μg/ml LPS和1 mg/ml克洛己新干混悬剂)。分别采用CCK-8法观察细胞活性变化;流式细胞术测定细胞凋亡水平;Western印迹检测Toll样受体(TLR)4、下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及核转录因子(NF)-κB的蛋白水平变化;DCFH-DA法检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α及白细胞介素(IL)-1β的蛋白水平。结果 LPS处理显著抑制BEAS-2B细胞活性,促进细胞发生凋亡,激活TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的活化(均P<0.05),还可显著增加细胞内ROS、TNF-α及IL-1β水平(均P<0.05)。同时给予细胞克洛己新干混悬剂治疗可显著逆转上述变化(均P<0.05),并可抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活(均P<0.05)。结论 克洛己新干混悬剂可能通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路的激活,从而保护支气管上皮细胞减轻LPS诱导的炎症反应。

柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞炎症因子及HMGB1/TLR4/NF-κB的影响

目的探讨柴朴汤对哮喘小鼠支气管上皮细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)及下游炎症介质单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)的影响。方法将小鼠支气管上皮细胞分为对照组(Con组,空白血清培养)、Model组(哮喘小鼠血清培养)和Chaipu组(柴朴汤药血清培养)。采用qRT-PCR和Western blotting检测小鼠支气管上皮细胞中HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6的mRNA及蛋白表达情况,ELISA法测定细胞培养液中MCP-1和IL-6的水平。结果与Con组相比,Model组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、NF-κB、MCP-1、IL-6表达均明显升高(P<0.05);Model组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著升高(P<0.05)。与Model组相比,Chaipu组小鼠支气管上皮细胞HMGB1、TLR4、MCP-1、IL-6 mRNA和蛋白表达降低,NF-κB m RNA表达亦降低(P<0.05);Chaipu组细胞培养液中MCP-1、IL-6也显著降低(P<0.05)。结论柴朴汤可下调哮喘血清诱导的炎症因子的表达,可能与其抑制HMGB1/TLR4/NF-κB炎症通路有关。

lncRNA OIP5-AS1靶向miR-7-5p对LPS诱导的人支气管上皮细胞损伤的影响

小儿哮喘是临床常见的一种疾病类型,由支气管上皮细胞损伤与功能障碍导致,在外界刺激性物质作用下支气管上皮细胞结构及功能被破坏而产生炎症因子,炎症因子大量释放与细胞凋亡数量增加是引起哮喘患儿支气管上皮细胞损伤的重要原因,目前人支气管上皮细胞损伤的分子机制尚未完全阐明[1-2]。研究表明长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)在重症哮喘患者中表达异常,并可能参与哮喘的形成机制,还可调节支气管上皮细胞凋亡、炎症等生物学过程[3-4]。lncRNA OIP5-AS1在屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中表达升高,并可通过miR-143-3p/HMGB1轴促进屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞炎症反应[5]。本研究通过生物信息学预测发现OIP5-AS1与miR-7-5p存在结合位点。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人支气管上皮细胞建立细胞损伤模型,探讨OIP5-AS1/miR-7-5p分子轴在人支气管上皮细胞损伤发生过程中的作用机制。

尘螨经PI3K通路对人支气管上皮细胞和血管内皮生长因子表达的影响及可能的调控机制

目的探讨尘螨经PI3K通路对人支气管上皮细胞(16-HBE)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及可能的调控机制。方法培养16-HBE细胞,根据不同尘螨刺激浓度和10μmol/LLY294002分为正常对照组、尘螨100 U/L组、尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、尘螨2000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组。采用四唑盐(MTT)比色法检测不同尘螨浓度的16-HBE活力,再检测LY294002组、LY294002+尘螨400 U/L组及正常对照组16-HBE活力,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测量不同条件刺激下16-HBE的VEGF mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测不同条件刺激下16-HBE的VEGF蛋白水平。结果尘螨2000 U/L组细胞活力低于正常对照组、尘螨100 U/L组、尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600U/L组、尘螨800U/L组及尘螨1000 U/L组(P<0.05)。LY294002组、LY294002+尘螨400 U/L组、正常对照组16-HBE活力比较差异无统计学意义。正常对照组VEGF(165)mRNA表达水平低于尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组,尘螨200U/L组低于尘螨400U/L组,高于LY294002+尘螨400U/L组、LY294002组,尘螨400U/L组高于尘螨600U/L组、尘螨800U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组均高于LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨400 U/L+LY294002组高于LY294002组(P<0.05)。正常对照组16-HBE培养上清VEGF蛋白水平低于尘螨200 U/L组、尘螨400 U/L组、尘螨600 U/L组、尘螨800U/L组、尘螨1000U/L组、尘螨400U/L+LY294002组,尘螨200 U/L组低于尘螨600 U/L组,高于尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨400 U/L组高于尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组、尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨600 U/L组、尘螨800 U/L组均高于尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组、LY294002组,尘螨1000 U/L组、LY294002+尘螨400 U/L组均高于LY294002组(P<0.05)。结论尘螨经PI3K通路16-HBE在VEGF mRNA和蛋白水平上的高表达,其机制可能是经由PI3K与哮喘密切相关信号通路,为尘螨导致哮喘的可能机制提供新线索,可为哮喘的治疗带来新思路。

lncRNA-NR_046269对马尔尼菲篮状菌感染人支气管上皮细胞早期IL-6表达的影响

目的:探讨lncRNA-NR_046269对马尔尼菲篮状菌(TM)感染人支气管上皮细胞早期IL-6表达的影响。方法:实验组和对照组分别用TM孢子和RPMI1640培养基与BEAS-2B细胞株共孵育4 h,生物信息学方法筛选NR_046269/IL-6关系对子,采用慢病毒载体转染BEAS-2B细胞株,分别敲低和过表达NR_046269,验证NR_046269对IL-6有无调控作用。结果:生物信息学分析显示,NR_046269与IL-6呈显著负相关(PCC=-0.998,P<0.05)。qPCR和ELISA结果均显示实验组IL-6表达显著降低(P<0.05)。NR_046269敲低组IL-6表达显著升高,而NR_046269过表达组IL-6表达显著降低(P<0.05)。结论:人支气管上皮细胞在TM感染早期IL-6表达显著降低。通过负调控IL-6表达,lncRNA-NR_046269有望成为临床治疗TM的新靶点。

DVC1在氮芥致人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用

目的探讨蛋白水解酶DVC1在氮芥诱导人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用。方法利用siRNA干预DVC1表达,50μmol/L氮芥染毒细胞后,采用Western blot检测DNA损伤修复蛋白的表达;荧光酶标仪测定1~24 h DNA-蛋白交联总量;Slot blot检测DNA与O 6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O^(6)-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)的共价交联;免疫沉淀检测MGMT泛素化水平。构建GST-DVC1融合蛋白,GST下拉实验检测DVC1与MGMT、泛素的结合。结果si-DVC1干预后,DNA-蛋白交联总量升高。氮芥降低交联蛋白MGMT原型的水平,但增强其泛素化水平;DVC1可结合泛素,si-DVC1可进一步增强MGMT的泛素化及DNA-MGMT的交联量,与泛素结合酶抑制剂NSC697923和蛋白酶体抑制剂MG132引起的交联结果类似。si-DVC1引起DNA损伤修复蛋白Rad51表达降低、Ku70表达升高。结论DNA-蛋白交联的清除依赖于交联蛋白的泛素化;DVC1通过与泛素相互作用,促进氮芥诱导的DNA-蛋白交联的清除,并维持DNA以同源重组方式修复损伤的能力。

miR-98-5p靶向HIF1AN对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡及炎症因子的影响

目的:探讨miR-98-5p对LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡、炎症因子的影响及对HIF1AN的调控作用。方法:体外培养人支气管上皮细胞16-HBE,LPS刺激细胞建立细胞损伤模型(LPS组),分别将miR-NC、miR-98-5p mimics、si-NC、si-HIF1AN、pcDNA-NC、pcDNA-HIF1AN、miR-98-5p mimics与pcDNA-NC、miR-98-5p mimics与pcDNA-HIF1AN转染至16-HBE细胞后进行LPS处理(miR-NC+LPS组、miR-98-5p+LPS组、si-NC+LPS组、si-HIF1AN+LPS组、pcDNA-NC+LPS组、pcDNAHIF1AN+LPS组、miR-98-5p+pcDNA-NC+LPS组、miR-98-5p+pcDNA-HIF1AN+LPS组);qRT-PCR与Western blot分别检测miR-98-5p、HIF1AN表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1α水平;双荧光素酶报告实验检测miR-98-5p、HIF1AN的靶向关系;Western blot检测Cleaved-caspase-3、HIF1AN、BNIP3蛋白表达。结果:转染miR-98-5p mimics或si-HIF1AN可明显降低LPS诱导的16-HBE细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达及TNF-α、IL-6、IL-1α水平(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-98-5p可靶向结合HIF1AN;共转染miR-98-5p mimics与pcDNA-HIF1AN可明显提高细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、BNIP3蛋白表达及TNF-α、IL-6、IL-1α水平(P<0.05)。结论:miR-98-5p过表达可通过下调HIF1AN表达抑制LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡及炎症因子释放进而减轻细胞损伤。

沉默lncRNA NEAT1通过抑制NF-κB通路减轻LPS诱导的支气管上皮细胞炎症反应

目的探究沉默长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1对脂多糖(LPS)诱导的人支气管上皮(HBE)细胞(16HBE)炎症反应的影响及机制。方法16HBE细胞分为Control组、LPS组、LPS+si-NC组和LPS+si-NEAT1组。实时荧光定量PCR检测各组lncRNA NEAT1、白细胞介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达水平;MTT法检测细胞增殖活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blotting检测各组炎症因子水平及增殖细胞核抗原(PCNA)、p53、核因子κB抑制蛋白(IκB)α、核因子-κB(NF-κB)p65蛋白表达水平。结果沉默lncRNA NEAT1后,IL-1β、IL-6、TNF-α及其mRNA表达水平、细胞凋亡率及p53、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白水平均明显降低,细胞增殖活力及PCNA蛋白水平均明显升高(P<0.05),细胞中p-NF-κB p65相对荧光强度(细胞核/细胞质)降低(P<0.05)。结论沉默lncRNA NEAT1表达抑制16HBE细胞炎症反应,其机制可能与抑制NF-κB通路的激活有关。

香烟烟雾提取物对人支气管上皮细胞中脂质代谢的影响研究

目的基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术研究香烟烟雾提取物(CSE)对人支气管上皮细胞(HBECs)中脂质代谢的影响。方法体外建立CSE干预HBECs模型,以5%CSE干预的支气管上皮细胞为实验组,以无CSE干预的细胞为对照组,采用LC-MS技术定量检测HBECs内的脂质成分,数据经主成分分析及正交偏最小二乘法判别分析,从728个脂质(11类脂质)中筛选出差异脂质。结果与对照组比较,实验组的HBECs显示出191个差异表达脂质,有185个脂质上调,6个脂质下调,其中增高数量比例最高的脂质为鞘脂途径脂质,增高倍数最大的脂质为甘油三酯。结论CSE可导致HBECs的脂质代谢紊乱,尤其是鞘脂途径脂质的积累,可能与慢性阻塞性肺疾病进程相关。

炎症在化脓隐秘杆菌引起的支气管上皮细胞损伤中起关键作用

化脓隐秘杆菌是一种革兰氏阳性、不运动、无孢子、短的棒状或球状的细菌,可单独、成对或成群出现。在世界范围内,化脓隐秘杆菌经常从家畜和野生动物的化脓性疾病如肺炎、心内膜炎、胸膜炎的炎性产物和器官脓肿物中分离到。它在家畜的二次感染和混合感染中也起重要的作用。关于化脓隐秘杆菌对小鼠、猪精密肺组织切片及猪支气管上皮细胞的致病性及致病机制的研究少有报道。

烟草烟雾暴露的人支气管上皮细胞铁死亡情况观察及其机制

目的观察烟草烟雾暴露对体外培养的人支气管上皮细胞铁死亡的影响并分析其机制。方法正常人支气管上皮细胞BEAS-2B分别使用0、0.5%、1.0%和2.0%的烟草烟雾提取物(CSE)处理24 h,即为对照组、0.5%CSE组、1.0%CSE组及2.0%CSE组。采用EdU染色观察细胞增殖能力,CCK-8法观察细胞活性;比色法检测细胞Fe2+水平和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;流式细胞术观察细胞活性氧(ROS)水平;q-PCR法及Western blotting法观察铁死亡相关因子谷胱甘肽过氧化酶4(GPx4)、铁蛋白重链1(FTH1)及环加氧酶2(Ptgs2)mRNA及蛋白;碘化丙啶染色观察细胞死亡情况;透射电镜观察细胞线粒体结构。将BEAS-2B细胞分为Fer-1组、Nec-1组、Z-VAD-FMK组及CSE组,分别给予铁死亡抑制剂Fer-1、坏死抑制剂Nec-1、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK及不加试剂预处理后,加入2.0%CSE培养基处理24 h。采用CCK-8法观察各组细胞活性;比色法检测Fer-1组、CSE组细胞Fe2+及GSH水平,流式细胞术观察Fer-1组、CSE组细胞ROS水平;q-PCR法及Western blotting法观察Fer-1组、CSE组细胞FTH1、Ptgs2、GPx4mRNA及蛋白表达;碘化丙啶染色观察Fer-1组、CSE组细胞死亡情况。结果EdU阳性细胞数、细胞OD值对照组>0.5%CSE组>1.0%CSE组>2.0%CSE组;细胞Fe2+水平、ROS水平对照组<0.5%CSE组<1.0%CSE组<2.0%CSE组,GSH水平对照组>0.5%CSE组>1.0%CSE组>2.0%CSE组;细胞FTH1、GPx4 mRNA及蛋白对照组>0.5%CSE组>1.0%CSE组>2.0%CSE组,Ptgs2 mRNA及蛋白对照组<0.5%CSE组<1.0%CSE组<2.0%CSE组;细胞死亡率对照组<0.5%CSE组<1.0%CSE组<2.0%CSE组(P均<0.05)。透射电镜结果显示,BEAS-2B细胞经2.0%CSE处理后出现线粒体萎缩变小,线粒体双层膜密度增高,线粒体脊减少甚至消失等典型铁死亡线粒体超微结构改变。细胞OD值Fer-1组>Nec-1组、Z-VAD-FMK组、CSE组;Fer-1组细胞Fe^(2+)、ROS水平低于CSE组,GSH水平高于CSE组;Fer-1组细胞FTH1、GPx4 mRNA及蛋白高于CSE组,Ptgs2 mRNA及蛋白低于CSE组;细胞死亡率Fer-1组低于CSE组(P均<0.05)。结论烟草烟雾暴露可诱导BEAS-2B细胞发生铁死亡,该作用可能通过介导BEAS-2B细胞铁超载和氧化还原紊乱来实现。

沉默circANKRD11靶向miR-218-5p对RSV诱导的支气管上皮细胞损伤的影响

目的探究沉默circANKRD11对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的支气管上皮细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法采用RSV诱导人支气管上皮细胞HBECs建立细胞损伤模型,相应转染后用含有感染复数为0.0001 RSV的培养基培养24 h;qRT-PCR法检测circANKRD11、miR-218-5p、TNFR1和BRD4的表达量;CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;ELISA法检测IL-6、IL-1β的水平;双荧光素酶报告实验检测circANKRD11与miR-218-5p的靶向关系;Western blot法检测Bax、Bcl-2、TNFR1和BRD4蛋白表达量。结果RSV诱导的HBECs中circANKRD11的表达量升高(P<0.05),miR-218-5p的表达量降低(P<0.05),TNFR1和BRD4表达量升高(P<0.05);转染si-circANKRD11或转染miR-218-5p mimic后,RSV诱导的HBECs细胞增殖的抑制率下降,炎症因子含量降低,凋亡细胞数减少(P<0.05);circANKRD11可充当miR-218-5p的分子海绵而靶向结合miR-218-5p;共转染si-circANKRD11与miR-218-5p inhibitor可恢复转染si-circANKRD11对RSV诱导的HBECs增殖、凋亡及炎症的作用。结论沉默circANKRD11可通过上调miR-218-5p表达抑制TNFR1和BRD4表达,促进细胞增殖及抑制细胞凋亡和炎症反应从而减轻RSV诱导的支气管上皮细胞损伤。

洋甘菊活性组分对LPS诱导人支气管上皮细胞的保护作用及机制研究

目的基于驱动蛋白家族3A基因(Kif3a)和Sonic hedgehog(SHH)信号通路探讨洋甘菊活性组分对脂多糖(LPS)诱导的人支气管上皮细胞(16HBE)的保护作用及机制。方法用脂多糖诱导人支气管上皮细胞建立哮喘炎症细胞模型。CCK-8法检测不同浓度洋甘菊活性组分对脂多糖诱导人支气管上皮细胞的增殖的抑制作用,筛选出最佳洋甘菊活性组分给药浓度。将细胞分为空白对照组、脂多糖模型组、阳性药物组(1μmol·L^(-1)地塞米松干预2 h)、洋甘菊活性组分组(200μg·mL^(-1),48 h)。Annexin V/PI结合流式细胞术检测各组的凋亡率。实时荧光PCR法和Western blot法检测Kif3a、SHH、Ptch1和Gli1的mRNA和蛋白表达变化。结果脂多糖干预后,可显著降低人支气管上皮细胞活力(P<0.05),并诱导其细胞凋亡(P<0.01)。洋甘菊活性组分在浓度200μg·mL^(-1)处理48 h时,可以显著逆转脂多糖对细胞的损伤并促进增殖(P<0.01),减弱脂多糖诱导的细胞凋亡(P<0.01)。与空白对照组比较,脂多糖诱导的人支气管上皮细胞内Kif3a在mRNA水平和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),SHH、Ptch1、Gli1在mRNA水平和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与脂多糖模型组相比较,洋甘菊活性组分处理后可显著逆转mRNA水平和蛋白表达(P<0.05),增加Kif3a的mRNA水平和蛋白表达水平,并降低SHH、Ptch1、Gli1的mRNA水平和蛋白表达(P<0.05)。结论脂多糖诱导人支气管上皮细胞损伤,下调Kif3a水平从而上调SHH、Ptch1、Gli1水平,调控SHH信号通路处于异常激活状态。洋甘菊活性组分可显著逆转脂多糖诱导的细胞炎症损伤,上调Kif3a水平,下调SHH、Ptch1、Gli1水平,通过Kif3a调控SHH信号通路,对脂多糖诱导的人支气管上皮细胞发挥保护作用,改善哮喘气道炎症。

贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化

背景与目的:实验研究和流行病学调查结果表明,铀可广泛地影响人体健康,但其远期效应,特别是致癌性,还缺乏明确的结论。本文模拟人吸入贫铀(depleteduranium,DU)气溶胶的情形,研究难溶性贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化及肺癌相关基因表达谱。方法:用难溶性贫铀氧化物(dUO2)作用腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B),通过观察不同代龄细胞的倍增时间、血清抗性、半固体琼脂克隆形成率及裸鼠成瘤性,鉴定细胞的恶性转化特性;用213个肺癌相关基因的芯片对贫铀诱发的转化BEAS-2B细胞的基因表达谱进行检测。结果:贫铀作用后的第5代BEAS-2B细胞倍增时间明显缩短,血清抗性显著增强;第10代细胞具有锚着独立性生长特性(半固体琼脂克隆形成);第15代裸鼠体内成瘤。二甲亚砜(DMSO)对贫铀诱发的BEAS-2B细胞恶性转化有明显保护效果。213个肺癌相关基因的芯片检测结果表明,转化细胞中有70多个基因的表达水平发生明显改变,其中10余个基因表达水平明显下降。结论:贫铀在体外具有致癌性。