胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠ蛋白单克隆抗体制备和抗原表位初步鉴定

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)Ⅰ型ApxⅠ毒素(ApxⅠ)AI2蛋白特异性单克隆抗体,进而建立用于评估亚单位疫苗免疫效果的阻断ELISA方法,以实验室前期筛选得到的ApxⅠ抗原优势决定簇AI2重组蛋白为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠。利用常规细胞融合和间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,获得4株单克隆抗体,命名为2C2、4E4、5E7和6F2,上清液效价分别为1∶6400、1∶6400、1∶12800和1∶6400。ELISA与Western blot结果表明,制备的4株单克隆抗体均与重组AI2蛋白有良好的反应性。其中5E7可与APP天然ApxⅠ毒素蛋白特异性结合,同时4株单克隆抗体均不与多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌、猪丹毒丝菌、副猪格拉菌和猪链球菌2型反应。亚类分型结果表明,2C2、4E4、5E7属于IgG1亚类,6F2属IgG2a亚类,4株单抗轻链均为κ链。通过构建AI2重组蛋白截短体,初步确定线性表位在74~93 aa之间。本研究成功制备了4株针对AI2蛋白单克隆抗体,为APP亚单位疫苗免疫效果评估方法的建立奠定了基础。

一起放线杆菌引起的SD大鼠感染的病例分析

实验动物疾病的发生与实验的成败紧密相关,为避免干扰实验结果,尽可能地达到预期效果,要对实验动物的疾病进行干涉。本案例通过解剖和病原学检测的手段确定普通环境设施实验动物房中SD大鼠突发性死亡的病原,结果表明该案例为一起由放线杆菌引起的SD大鼠突发性死亡。同时,对普通级实验动物房SD大鼠的健康饲养模式进行了探讨,以期为实验动物疾病防控及预警提供参考。

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白重组腺病毒载体构建及免疫原性研究

研究旨在构建胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ蛋白的复制缺陷型5型腺病毒载体的重组腺病毒。构建包含胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ基因的穿梭质粒pDC316-APXⅡ,并与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E13Cre共转染Hek293细胞,获得了重组腺病毒rAd-APXⅡ,将纯化后的重组腺病毒rAd-APXⅡ肌肉注射小鼠进行免疫原性分析。结果显示,试验成功构建了pDC316-APXⅡ质粒以及包装了rAd-APXⅡ病毒。rAd5-Null组未产生特异的APXⅡIgG抗体;低和高浓度rAd-APXⅡ组均可产生较高的APXⅡIgG抗体,其中高浓度组产生的抗体水平显著高于低浓度组(P<0.05);某疫苗组产生的抗体水平显著高于rAd-APXⅡ低浓度组(P<0.05),但低于rAd-APXⅡ高浓度组(P<0.05)。低、高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体显著高于rAd-Null组(P<0.05);高浓度rAd-APXⅡ组和疫苗组抗体显著高于低浓度rAd-APXⅡ组(P<0.05)。研究表明,rAd-APXⅡ重组腺病毒免疫小鼠能够产生特异性抗体并显示良好的免疫原性。

胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素抗原优势决定簇的筛选和融合表达

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法,本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ~Ⅲ)生物学信息分析的基础上,以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ~Ⅲ分段扩增后进行截短表达,获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析,确定ApxⅠ~Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列,无缝克隆3个蛋白片段基因,通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。

胸膜肺炎放线杆菌分离株血清型的PCR鉴定和Apx毒素基因检测

旨在调查胸膜肺炎放线杆菌流行株的血清型及Apx毒素基因携带情况,采用PCR方法对APP分离株进行血清型鉴定和Apx毒素基因检测。结果表明,64个分离株分别被鉴定为2、5、7、8、12、15、19共7个血清型。7个血清型中发现12种不同的Apx毒力因子模式。毒力因子分析结果显示,同一血清型的不同菌株携带的Apx毒素基因存在差异,不同血清型的菌株也可能会携带相同模式的Apx毒素基因。本研究表明,血清8型胸膜肺炎放线杆菌是浙江省的优势血清型,血清19型菌株在国内首次被检测到。血清型与所携带的Apx毒素基因之间不存在必然联系。

胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

抗菌肽BNBD5调节肺脏先天免疫抵御胸膜肺炎放线杆菌感染的研究

【目的】探究抗菌肽牛中性粒细胞β防御素5(bovine neutrophilβ-defensins 5,BNBD5)调节肺脏先天免疫抵御胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染的作用,为防控猪胸膜肺炎提供试验基础和理论支持。【方法】将30只雌性BALB/c小鼠随机分为3组,即正常对照组(Con)、APP感染对照组(APP)、抗菌肽BNBD5预处理后感染APP组(B5),每组10只,Con组小鼠鼻内给予2次PBS(20μL/只),每次间隔2 d;APP组鼻内给予2次PBS(20μL/只),间隔2 d,3 d后感染APP(107 CFU/只);B5组小鼠鼻内给予2次抗菌肽BNBD5(20μg/只),间隔2 d,3 d后鼻内感染APP(107 CFU/只),感染6 h后剖杀所有小鼠,观察肺脏和脾脏的病变,测定脏器系数和肺脏中的细菌载量;HE染色观察肺脏组织病理变化;ELISA检测肺脏组织匀浆液中的细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-23、IL-17和IL-22水平;流式细胞术检测肺脏中的中性粒细胞数量。【结果】与Con组相比,APP组小鼠被毛粗乱、精神萎靡,肺脏肿大,可见明显斑块状或点状出血,镜下可见肺脏组织有明显出血和大量炎性细胞浸润,肺脏中TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-22和IL-23细胞因子水平变化不显著(P>0.05),但均呈不同程度下降,中性粒细胞数量减少;与APP组相比,B5组小鼠精神状态较好,肺脏肿胀程度减轻,肺脏指数显著降低(P<0.05),未见明显斑块状出血,肺脏中的细菌载量极显著减少(P<0.01),肺脏中炎性细胞明显减少,肺脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-22水平显著升高(P<0.05),肺脏组织中中性粒细胞数量极显著增多(P<0.01)。【结论】抗菌肽BNBD5能在感染早期改善APP引起的肺脏免疫抑制,增强肺脏先天免疫杀伤胸膜肺炎放线杆菌。

产琥珀酸放线杆菌利用甘薯粉产丁二酸发酵条件优化

为了优化产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)发酵甘薯粉生产丁二酸的发酵培养基,提高丁二酸产量,降低生产成本,本研究首先通过单因素实验对甘薯粉发酵产丁二酸的甘薯粉、MgCO_(3)、液化酶、糖化酶、氮源浓度和发酵时间进行了优化,再利用正交试验确定重要参数的最佳水平,最后利用2 L发酵罐对获得最佳发酵工艺进行放大实验。结果表明,混合氮源(酵母粉:玉米浆=1:2)可满足甘薯粉丁二酸发酵营养需求,影响丁二酸产量的重要参数是甘薯粉、MgCO_(3)、液化酶、糖化酶、混合氮源(酵母粉:玉米浆=1:2)的浓度。各因素最佳水平为:甘薯粉115 g/L、MgCO_(3)60 g/L,液化酶0.008 KUN-S/g底物,糖化酶3.09 AGU/g底物,混合氮源33 g/L。优化后丁二酸产量可达69.89 g/L,与优化前相比(42.46 g/L),丁二酸浓度提高了64.6%。2 L发酵罐发酵72 h,丁二酸可达71.42 g/L,丁二酸产率为79.87%,生产强度为0.99 g/(L·h)。因此,利用A.succinogenes发酵甘薯粉产丁二酸具有较好的工业化应用前景。

猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株分离鉴定及生物学特性研究

新疆南疆某规模猪场发生疑似猪传染性胸膜肺炎,为确定其病原,对采集的发病猪肺脏样品进行了细菌分离、生化试验、PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等。结果表明,从该规模养猪场分离获得1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,经生物学特性分析、PCR检测鉴定为APP生物Ⅰ型、血清型1型。致病性试验结果显示该分离株对小鼠具有致病性,药敏试验显示该菌株对环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物具有敏感性。经耐药基因检测分析,该病原为携带floR耐药基因的血清型1型猪胸膜肺炎放线杆菌。

猪胸膜肺炎放线杆菌(15型)的分离鉴定

猪传染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种猪的致死性呼吸道传染病。该病在我国发病率常年居高不下,以出血性、坏死性胸膜肺炎为主要特征,任何年龄的猪均可发生,可引起猪的急性死亡,给养猪业带来较大的经济损失。该病的慢性和无症状感染是暴发流行的潜在因素,因此,早期诊断是防治该病成败的关键。

胸膜肺炎放线杆菌纳米PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种高效、灵敏的胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测方法,本研究针对APP的血清型保守基因-毒素4(APxⅣ)序列合成特异性引物,通过优化引物浓度、退火温度等建立了APP纳米PCR检测方法。敏感性试验结果显示,该纳米PCR对APP的检测下限为1×10^(2)CFU/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍;特异性结果显示,该方法仅从APP核酸样品可检测到约417 bp的特异性目的条带,而对猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金色葡萄球菌等其他病原的检测结果均为阴性;应用本研究建立的纳米PCR技术检测了41份临床疑似APP感染病料,结果显示常规PCR和纳米PCR检测APP阳性率分别为17.07%(7/41)和19.51%(8/41)。以上结果表明,本研究成功建立的APP纳米PCR检测方法敏感性高、特异性好,可用于APP感染的临床诊断及流行病学调查。

胸膜肺炎放线杆菌感染猪肺巨噬细胞相关细胞因子表达水平初探

为进一步探究胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)感染仔猪的致病机制,利用SYBR Green荧光定量PCR方法,探究仔猪感染后IL-1β、IL-6、IL-8及caspase-3基因表达水平的变化。通过肺灌洗液获得猪肺巨噬细胞,将APP以MOI=10的剂量感染细胞,并对经APP感染后的肺巨噬细胞相关细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8及caspase-3)基因表达水平进行检测。结果显示,APP感染后3~12 h,IL-1β、IL-6、IL-8及caspase-3基因表达量呈升高趋势,感染后12~24 h达到高峰。结果提示,APP感染早期IL-1β、IL-6、IL-8等细胞因子在宿主清除致病菌过程中发挥着重要作用。本研究为下一步深入探索APP致病机制奠定了基础。

育肥猪圆环病毒和胸膜肺炎放线杆菌混合感染的诊断及防控措施分析

随着生猪养殖业的快速发展,各类传染性疾病的发生率逐年提高。猪圆环病毒与胸膜肺炎放线杆菌混合感染的几率在逐年增加,给诊治工作带来较大的难度,增加了患猪的致死率。在养殖过程中,工作人员需增强对本病的了解,对于异常猪只及时地做出诊断,根据临床类型和症状给出相应的治疗方案,以免延误治疗。同时以预防为主,加强对本病的预防工作,提高猪群自身的免疫能力,降低本病的发生率。

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及增殖影响

为研究感染APP对猪外周血免疫功能影响，将24头健康杜洛克、长白猪和约克夏三元杂交（DLY）仔猪按性别、体重分为2组，分别用生理盐水（对照组CG）和含3．8×10^7CFU．mL^-1猪放线杆菌（APP）稀释液（试验组TG）喷雾鼻腔。

反相高效液相色谱法测定产琥珀酸放线杆菌发酵液中的有机酸

提出了一种利用高效液相色谱法分析产琥珀酸放线杆菌发酵液中有机酸的方法。在EclipseXDB C8(4 .6mmi.d .× 1 5 0mm ,5 μm)色谱柱上 ,以 0 .0 0 5mol L硫酸溶液 (pH 2 .5 )作流动相 ,流速为 1mL min ,紫外检测波长 2 1 0nm。 7min内可以把 6种混合酸标样完全分离定量。发酵液经离心后直接进样分离定量 ,其中的琥珀酸、乳酸的回收率大于 97%。经多次实验结果证明 :本方法是测定琥珀酸发酵液中各有机酸的快速、有效的定量测定方法。

猪放线杆菌性胸膜肺炎的防治

近年来,猪放线杆菌性胸膜肺炎时有发生,极大地困扰着养殖户和种猪场,给养猪业带来了严重的损失。本文就该病的诊治与预防做一详细介绍,希望给养殖户带来帮助。一、流行情况猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎,可发生于任何年龄的猪只,呈世界性分布,目前已有30多个国家和地区报道有该病发生,是国际公认危害现代养猪业五大重要传染病之一,尤其在集约化养猪场一旦发生会造成重大经济损失。我国该病的发病率有逐年增加的趋势。

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性．【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取，采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性；并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性．【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma cop-tidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度（ Minimal inhibitory concentration ，MIC）范围是6.25～50.00 mg/mL；大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00～100.00 mg/mL；黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japoni-ca、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC＞100.00 mg/mL．联合抑菌试验结果表明，乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数（FICI）≤1，乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI＞2．乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性；乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用；秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用．

反相HPLC同时测定产琥珀酸放线杆菌发酵液中的有机酸与葡萄糖

提出了一种利用高效液相色谱法同时分析产琥珀酸放线杆菌发酵液中葡萄糖和有机酸的方法。在EclipseXDB C8(150mm×Φ4.6mm,5μm)色谱柱上,以5mmol LH2SO4溶液(pH2.5)作流动相,流速为1mL min,采用示差折光检测器,一次进样可同时定性及定量分析待测试样中的有机酸及葡萄糖,每一样品的分析时间不超过9min。确定了测定各物质的工作曲线的回归方程、线性范围、相关系数和检出限。测定发酵液中葡萄糖、琥珀酸和副产物乳酸的相对标准偏差在0.41%～0.89%范围内,平均回收率在99.6%～100.8%之间。

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌S4 0 74菌株毒素I的序列 ,设计了 1对引物 ,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I的结构基因 (apxICA) ,扩增的DNA片段大小为 36 4 0bp(4 6 87～ 832 6bp) ,将其克隆到pMD18 T载体中 ,酶切鉴定和序列测定后 ,进一步将其插入pET 2 8a中构建了原核表达载体 ,SDS PAGE和Westernblotting分析表明 ,该基因在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中获得了表达 ,而且表达的蛋白质具有免疫学活性。利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板 ,建立了检测毒素I血清抗体的ELISA方法。临床应用表明 。