临床分离铜绿假单胞菌喹诺酮耐药株gyrA基因突变及其对β-内酰胺类药物敏感性研究

利用 PCR、限制性片段多态性分析 (RFL P)、DNA单链构像多态性分析 (SSCP)和 DNA测序等方法 ,对 10株成都地区临床分离耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A基因进行研究。结果表明 ,成都地区耐喹诺酮类药物铜绿假单胞菌 gyr A的喹诺酮耐药决定区编码第 83位氨基酸密码子表现出高频单点突变 (10株中有 8株 ) ,其突变方式为 ACC→ATC。gyr A的 PCR扩增产物 Sac II酶切片段与测序结果一致。SSCP的带谱与测序结果比较 ,除 1株 (PSA2 )的 SSCP带谱与标准株相同 ,但测序结果有点突变外 ,其余菌株与测序结果一致。因此 ,利用 PCR- SSCP- RFL P系统 ,可快速、准确的检测耐喹诺酮类药物的铜绿假单胞菌 gyr A中至少一个碱基的差异。用二倍稀释法测定喹诺酮和 β-内酰胺类药物对耐药突变株体外抗菌活性 ,结果表明 ,铜绿假单胞菌 gyr A基因突变株对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢他啶、亚胺培南和哌拉西林表现出不同的敏感性。试验所用 8株突变株对诺氟沙星和环丙沙星表现出高水平抗性 ;3株对左氧氟沙星敏感 ;3株对头孢他啶和哌拉西林表现出耐药 ,2株对亚胺培南耐药。

大豆基因型对根癌农杆菌菌株敏感性的研究

以栽培大豆 [Glycinemax (L .)Mer]吉林 30、吉林 43、绥农 8、黑农 35和东农 42等的下胚轴为外植体 ,用EHA10 5和LBA44 0 42个根癌农杆菌菌株 (分别含有 pGBI12 1S4ABC和pGBI4A2B质粒 )研究大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性 ,以及根癌农杆菌对大豆的侵染能力。结果表明 ,大豆基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差异 ,以吉林 43最敏感。根癌农杆菌菌株对大豆下胚轴侵染能力不同 ,含有 pGBI12 1S4ABC质粒的LBA44 0 4侵染能力较强 ,但差异未达显著水平。

一株多重耐药大肠杆菌耐喹诺酮gyrA基因突变的研究

临床获得 1株鸡致病性大肠杆菌CE0 1,进行药敏、质粒转化、耐药质粒消除试验 ,结果该菌对 11种受试抗菌药物全部呈高度耐药 ,其中氧氟沙星的MIC≥ 5 0 μg/ml,且含有喹诺酮抗性质粒 ,溴化乙淀和黄连素作为消除剂作用 48小时可使其喹诺酮抗性质粒消除 ,耐药水平显著下降。聚合酶链反应 (PCR)扩增该菌gyrA基因喹诺酮耐药决定区 (QRDR) ,质粒DNA和染色体DNA均可扩增出长度为 6 6 8bp的PCR产物片段。经测序分析 ,两者基因序列相同率为 98.17%,相同位点突变相同的碱基有 5个 ,相同位点突变不同的碱基有 2个 ;与基因数据库Swanberg等报道的大肠杆菌gyrA基因相应序列比较 ,该菌质粒DNAPCR产物同源率 97.8%,有 13个位点发生突变 ,3个氨基酸被替换 ;染色体DNAPCR产物同源率 98%,有 12个位点发生突变 ,2个氨基酸被替换。用放射性同位素α_3 2 P分别标记CE0 1菌株染色体DNA和质粒DNA的PCR扩增片段制备探针 ,对CE0 1菌株进行检测。质粒DNA和染色体DNA分别与质粒探针和染色体探针杂交出现典型的阳性杂交斑。证实该菌株质粒和染色体上同时存在耐喹诺酮gyrA突变基因 ,对喹诺酮的耐药性是质粒介导和染色体突变共同作用的结果。

鼠疫耶尔森菌株间遗传关系的数值化分析

目的 :显示不同鼠疫菌株之间的遗传学关系。方法 :将鼠疫菌株间的相似程度数值化 ,进行聚类分析。结果 :检验菌株可以聚为 2个亚种 4个型。结论 :由一次流行而生的型彼此间相似程度较高 ,因各固有疫源地而生的型 ,其间的差异更为显著。

耐氟喹诺酮类药物禽源大肠埃希菌gyrA基因的检测分析

探讨不同禽源大肠埃希菌中喹诺酮类药物的耐药情况及耐药基因gyrA的分布和突变特征。采用K-B药敏纸片法、gyrA基因的PCR扩增,对9株大肠埃希菌进行喹诺酮类药物试验,并将gyrA基因的PCR产物测序,对测序结果采用DNA MAN、DNA Star、MEGA6等软件分析。药敏试验结果表明,C1、C2、C3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星敏感,D1、D2、D3、B1、B2和B3菌株对左氧沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星均表现为耐药和中介;gyrA基因的测序结果表明,除B1菌株有1处核苷酸突变位点和B2菌株有14处核苷酸突变位点;B2菌株gyrA基因的氨基酸突变发生在87位Ile→Val替代、101位Leu→Met替代、102位Ala→Ser替代、129位Lys→Gln替代。9株禽源大肠埃希菌的同源性和进化树分析表明,不同禽源耐氟喹诺酮类药物的大肠埃希菌菌株中B2菌株gyrA基因与其他9株菌株相比,同源性在90%左右,进化树不在一个分支上,研究中的B2菌株将为大肠埃希菌的氟喹诺酮类耐药机制的研究提供候选菌株。

大肠埃希菌氨基糖苷类耐药株aac(3)—Ⅱ基因保守区分析

常规分离鉴定47株大肠埃希菌,以标准纸片扩散法(K—B法)对其进行常用氨基糖苷类药物敏感性测定,耐药株经PCR检测aac(3)—Ⅱ基因保守区,扩增产物进行DNA测序分析。初步探讨大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药株与aac(3)—Ⅱ基因保守区之间的关系,结果显示本地区大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药株的aac(3)—Ⅱ基因保守区具65位G、84位T和65位A、84位C两种基因型,且高度耐药菌株皆为65位G、84位T。

Halomonas sp. TTW4盐敏感突变株的筛选与耐盐基因克隆

TTW4是本实验室自内蒙古盐湖中分离得到的一株中度嗜盐菌,经形态学、生理生化和16srDNA序列分析确定其属于Halomonas属。通过紫外诱变获得该菌株具有利福平抗性的突变株UV-1。利用三亲本杂交得到UV-1的8株盐敏感突变株。碘结晶法测定UV-1和突变株胞内甜菜碱含量,UV-1胞内甜菜碱最多可达190μg/mg,盐敏感突变株胞内甜菜碱含量有明显降低,一般在150μg/mg以下,最低的只有110μg/mg。以其中一株盐敏感突变株S3为实验材料,反向PCR扩增转座子Tn5插入位点侧翼序列,BLAST分析表明插入位点为色氨酸合酶α亚基基因,推测该基因与耐盐功能相关。

灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性

为明确灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性差异,将9个不同敏感型菌株在无药PDA平板上继代培养10代后,测定其对氟唑菌酰羟胺的敏感性。采用菌丝生长速率法分别在PDA平板和离体叶片上测定了其菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性,以及其对温度、pH值和葡萄糖的敏感性,并对其编码琥珀酸脱氢酶的SdhA、SdhB、SdhC和SdhD 4个亚基基因进行了克隆与测序。结果显示:从田间获得的2个低抗菌株、2个中抗菌株和2个高抗菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数在0.60~1.15之间,而通过室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数为0.23;除低抗菌株WP8的菌丝生长速率显著低于2个敏感菌株,以及中抗菌株WP6和高抗菌株WPE9的产孢量显著低于2个敏感菌株外,其余各抗性菌株在菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性方面均无显著差异。整体而言,7个抗性菌株在对温度、pH值和葡萄糖的敏感性方面与敏感菌株无显著差异。基因克隆及测序结果表明,室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F SdhB基因的272位由组氨酸变为了精氨酸(H272R),田间获得的低抗、中抗和高抗各2个菌株均为SdhB基因的225位由脯氨酸变为了亮氨酸(P225L)。综合分析表明,灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株具有相似的适合度。因此,推测在药剂的选择压下,抗氟唑菌酰羟胺的灰葡萄孢菌株在田间容易形成优势种群。

抗生素耐药性的持久性：评价益生素方法即用抗生素敏感菌株埃氏巨球形菌阻止抗生素耐药菌株在猪肠道的定植

埃氏巨球形菌是普遍存在于哺乳动物胃肠道的一种乳酸发酵型、严格厌氧菌。猪的埃氏巨球形菌具有较强的四环素耐药性（MIC=64～大于256μg／mL），且带有嵌合型四环素耐药基因。仔猪的肠道微生物来自母猪。来自母猪的埃氏巨球形菌能否在仔猪肠道定植，五种埃氏巨球形菌菌株灌注新生仔猪会影响来自母猪的耐药性埃氏巨球形菌的定植吗？

动物源菌多重耐药oqxAB基因药物敏感性分析

喹乙醇（Olaquindox）商品名为倍育诺、快育灵，具有促进蛋白同化、提高饲料转化率的作用，同时对细菌有一定的广谱抑制作用；对四环素、氯霉素等耐药菌株有效，所以喹乙醇作为一种抗菌和促进生长的饲料添加剂被广泛应用。

MRSA耐消毒剂及耐抗菌药物基因研究

目的 研究MRSA耐消毒剂及耐抗菌药物基因。方法 对20株MRSA的耐消毒剂基因(qacA)和9种主要耐抗菌药物基因[mecA、TEM、aac(6′)／aph(2″)、aph(3′)-Ⅲ、ant(3″)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ、ant(6)-Ⅰ、tetM、elm等]进行检测。结果 20株MRSA除对万古霉素、替考拉宁敏感外，对青霉素、苯唑西林、头孢唑林、头孢呋辛、亚胺培南、庆大霉素、四环素、红霉素、环丙沙星等均耐药。20株MRSA菌中，4株检qacA基因；20株均检出mecA、TEM、aac(6′)／aph(2″)、tetM、elm等β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、红霉素类耐药相关基因，其中6株还同时检出aph(3′)-Ⅲ基因。结论 全部菌株均已携带β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、红霉素耐药相关基因，部分菌对消毒剂耐药。

水稻白叶枯病菌对拌种灵抗药性分子机制研究

通过紫外诱变获得了抗拌种灵水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的突变体,这些突变体可以在含100ìg·ml-1拌种灵平板上生长,而敏感菌株在10μg·ml-1浓度下则不能生长。敏感菌株琥珀酸脱氢酶活性受拌种灵强烈抑制,而抗药突变体的酶活性较低,且不受药剂抑制。应用6对引物,从水稻白叶枯病菌野生敏感菌株和室内诱导抗药性菌株中扩增到琥珀酸脱氢酶基因全序列。该基因全长3616bp,编码1115个氨基酸,含有2个内含子。与柑橘溃疡病菌(Xanthomonasaxonopodispv.citri)琥珀酸脱氢酶核苷酸同源性93%,氨基酸同源性97%;与其它6种病原细菌琥珀酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列同源性为43%～95%。敏感菌株和抗药菌株的琥珀酸脱氢酶序列分析表明,琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基中229位氨基酸由组氨酸(CAC)突变为酪氨酸(TAC)是导致X.oryzae对拌种灵产生抗药性的主要原因。

大菱鲆病原鳗弧菌生物学及分子特征研究

从山东沿海养殖发病大菱鲆分离了5株鳗弧菌.5株菌对大菱鲆有较强的致病性,LD50范围为2.32×101～4.03×102 cfu/g鱼;5株菌分别属于O1、O2、O3血清型,菌株之间的16SrRNA基因序列相似性范围97.1%～99.9%;与国外报道的鳗弧菌的序列相似性范围为89.7%～99.9%.5株菌的生理生化特征与鳗弧菌标准菌株一致,能产生多种胞外酶和溶血素;都含有金属蛋白酶基因和溶血素基因,其中3株菌各含有一个67kb大质粒.病原菌对青霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅴ、先锋霉素Ⅵ、链霉素、强力霉素、洁霉素、万古霉素、灭滴灵等11种常用抗菌药物有抗性,只对新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素等4种药物敏感.

新生儿感染肺炎克雷伯菌的喹诺酮类耐药株gyrA基因研究

目的了解湖南地区新生儿感染肺炎克雷伯菌染色体介导喹诺酮类耐药基因gyrA基因的流行情况。方法采用PCR法对20株肺炎克雷伯菌进行gyrA基因检测,采用法国生物梅里埃公司生产的VITEK2-COMPACT全自动细菌鉴定检测16种抗菌药物的体外抗菌活性,PCR扩增产物经纯化后测序并进行序列分析。结果 gyrA基因耐药决定区的突变,其中17株都有第83位的改变,3株发现有第87位的改变。结论本省儿童感染肺炎克雷伯菌染色体介导喹诺酮类耐药基因gyrA基因突变情况十分普遍,监测其突变频率、位点对指导临床用药及耐药机制研究十分重要。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。

金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药情况调查

目的调查金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)对万古霉素的耐药情况,并对敏感性降低菌株进行基因分型。方法对132株临床分离的金黄色葡萄球菌分别进行2μg/ml、4μg/ml万古霉素脑心浸液琼脂生长试验,4μg/ml生长试验阳性菌株用随机引物聚合酶链反应进行基因分型。并用菌群分析法筛查对万古霉素异质性耐药金黄色葡萄球菌。结果62株(47.0%)金黄色葡萄球菌能在含2μg/ml万古霉素的脑心浸液琼脂上生长,9株(6.8%)金黄色葡萄球菌能在含4μg/ml万古霉素的脑心浸液琼脂上生长,但其MIC皆≤2μg/ml。9株菌株都能产生独特稳定的AP-PCR谱型。有1株金黄色葡萄球菌对万古霉素异质性耐药。结论未发现对万古霉素完全耐药或中介耐药的金黄色葡萄球菌,异质性耐药金黄色葡萄球菌分离率为0.75%;在本地区尚无对万古霉素敏感性降低的同源株的流行趋势。

志贺菌临床株喹诺酮类耐药与gyrA和parC基因点突变

近年来，肠杆菌科细菌对喹诺酮类耐药不断增加，国内外均有报道对喹诺酮类耐药的志贺菌，本文以志贺菌为例，一是了解和掌握杭州市志贺菌临床分离株喹诺酮耐药的流行趋势，对1998—2007年杭州地区分离到的202株志贺菌进行药敏实验，