敬钊毒素-Ⅲ对Nav1.8通道的抑制作用

敬钊毒素-Ⅲ（Jingzhaotoxin-Ⅲ,JZTX-Ⅲ）是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种门控调节型毒素,能选择性抑制钠通道亚型Nav1.5激活,但对其他6种钠通道亚型（Nav1.1~Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7）无抑制作用。为了更好地研究钠通道结构与功能之间的关系,采用全细胞膜片钳技术检测了JZTX-Ⅲ对表达在ND7/23细胞上的Nav1.8通道的影响。结果显示,JZTX-Ⅲ抑制Nav1.8电流,并且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性,抑制时间常数和IC50值分别为41.15±0.6 s和1.4±0.23μmol/L;1μmol/L JZTX-Ⅲ使Nav1.8通道的电流-电压关系曲线和激活曲线分别向去极化方向漂移10 mV和9 mV,使Nav1.8通道的稳态失活曲线向超极化方向漂移16 mV,明显改变Nav1.8通道的激活和稳态失活动力学。此外,钠通道序列比对结果提示JZTX-Ⅲ可能通过结合Nav1.8通道DIIS3~S4连接环上的Lys（K）残基抑制Nav1.8通道。以上研究结果为进一步探索钠通道结构与功能之间的关系奠定了基础。

虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素-Ⅲ对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响(英文)

HWTX-III是从中国虎纹捕鸟蛛Ornithoctonus huwena粗毒中分离纯化到的一种昆虫神经多肽。通过应用全细胞膜片钳技术研究了HWTX-III对美洲蜚蠊Periplaneta americana神经细胞电压门控离子通道的影响。发现HWTX-III特异性地抑制美洲蜚蠊背侧不成对中间(dorsal unpaired median,DUM)神经细胞的电压门控钠通道(IC_(50)≈1.106μmol/L),而对电压门控钾通道没有明显的影响。HWTX-III通过一种新型的不同于其他蜘蛛毒素的机制抑制昆虫电压门控钠通道,它不影响通道的激活与失活动力学,也不明显地漂移稳态失活曲线。HWTX-III对昆虫神经细胞电压门控钠通道的特异性与新型作用机制为研究电压门控钠通道分子结构的多样性以及开发新的安全的杀虫剂提供有用的工具。

海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ的固相化学合成和氧化复性

应用芴甲氧羰基(Fm o c)固相化学合成了海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ,并优化了其最佳氧化复性条件。最佳的氧化复性条件为pH7.5的重蒸水溶液体系,样品质量浓度为0.1g/L,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的浓度分别为1.0mm o l/L和0.1mm o l/L、L-A rg浓度为1.0m o l/L。复性产物经质谱测定其相对分子质量为3 607.68;与天然毒素等量混合后用高效液相色谱分析得到单一峰;膈神经-膈肌标本生理实验结果表明,合成的毒素具有与天然毒素相同的生物学活性,从而可确定二者在结构与功能上具有一致性。

抗凝血酶-Ⅲ对多器官功能障碍综合征大鼠细胞因子的影响

目的观察抗凝血酶(AT)对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠细胞因子的影响。方法Wistar大鼠70只随机分为3组:正常对照组(n=10)、模型组(n=30)和AT治疗组(n=30)。经股静脉注射脂多糖(LPS)2次(100μg/kg和200μg/kg)制备大鼠全身炎症反应综合征(SIRS)/MODS动物模型。AT治疗组在第2次LPS攻击后1h股静脉注射AT25U/kg(0.5ml/100g)。正常对照组和模型组注射等量生理盐水。4h后取血测定内毒素(ET)、白细胞介素1(IL1)、IL6和肿瘤坏死因子α(TNFα)含量,同时取肺、肾、肝组织进行组织病理学观察。结果模型组动物血清ET、IL1、IL6和TNFα水平均明显升高(P均<0.01)。AT治疗后血清ET、IL1、IL6和TNFα水平均明显下降,与模型组比较差异均有显著性(P均<0.01),但仍显著高于正常对照组(P<0.05或P<0.01);肺、肾、肝组织的病理学变化较模型组明显减轻。结论AT能够拮抗炎症反应,对SIRS/MODS具有治疗作用。

敬钊毒素-Ⅴ的合成、复性及其钾通道活性鉴定

敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化.复性产物的相对分子质量经质谱测定为3605.51,而与天然毒素混合进行HPLC共洗脱实验时也只得到单一峰.全细胞膜片钳实验显示,JZTX-Ⅴ能够抑制大鼠背根神经节细胞上的A型钾电流,却对外向延迟整流钾电流没有影响,对处于静息关闭状态的A-型钾通道也表现出较高的亲和性.JZTX-Ⅴ对A型钾通道的这种抑制作用具有浓度依从性,其半数有效抑制浓度(IC50)为52.3nmol/L·JZTX-Ⅴ通过引起A型钾通道的活化曲线往去极化方向漂移,和失活曲线往超极化方向漂移来改变通道的门控特征.目前的研究结果为深入开展JZTX-Ⅴ的功能研究及分子改造奠定了基础.

闹羊花毒素Ⅲ介导氧化应激途径对创伤后骨关节炎大鼠软骨损伤的影响

目的探讨闹羊花毒素Ⅲ对创伤后骨关节炎大鼠软骨损伤的影响及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组(根据交叉韧带切断法建模)、低剂量实验组(建模后灌胃给予0.12mg·kg^(-1)闹羊花毒素Ⅲ)、高剂量实验组(建模后灌胃给予0.24mg·kg^(-1)闹羊花毒素Ⅲ)、阳性药物组(建模后灌胃给予2mL/100g的硫酸氨基葡萄糖),每组10只大鼠,连续灌胃28d后,心脏采血并处死大鼠取软骨组织备用。以Mankin’s评分法分析各组大鼠软骨组织情况,以蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达水平,以酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清骨形成指标及软骨组织中相关因子表达水平,以试剂盒法检测氧化应激相关指标的表达水平。结果假手术组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和阳性药物组的Mankin's评分分别为(0.10±0.30)、(5.30±0.46)、(4.00±0.63)、(3.10±0.54)和(1.50±0.81)分,骨钙素(BGP)水平分别为(10.25±0.77)、(2.39±0.34)、(4.87±0.27)、(7.99±0.51)和(8.55±0.71)ng·mL^(-1),裂解的胱天蛋白酶-3(Cl-caspase-3)蛋白相对表达水平分别为0.25±0.02、0.86±0.06、0.65±0.05、0.47±0.04和0.33±0.03,超氧化物歧化酶(SOD)活性分别为(109.07±7.51)、(60.24±5.73)、(67.99±4.73)、(76.16±8.84)和(80.11±3.96)U·mg^(-1),核转录因子E2相关因子(Nrf2)蛋白相对表达水平分别为1.03±0.08、0.33±0.04、0.43±0.05、0.75±0.10和0.74±0.09,血红素加氧-1(HO-1)蛋白相对表达水平分别为0.88±0.08、0.27±0.04、0.39±0.04、0.56±0.10和0.58±0.06;模型组的上述指标与假手术组比较,低、高剂量实验组的上述指标分别与模型组比较,低剂量实验组的上述指标与高剂量实验组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论闹羊花毒素Ⅲ可能通过激活Nrf2/HO-1通路,抑制氧化应激、炎性反应、调节骨代谢,改善创伤后骨关节炎大鼠软骨损伤。

闹羊花毒素Ⅲ通过调控Wnt1/Dvl1/β-catenin通路影响成纤维样滑膜细胞增殖凋亡的实验研究

目的探讨闹羊花毒素Ⅲ对类风湿关节炎(RA)的治疗作用及其机制。方法采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLS细胞)作为RA的细胞模型。以雷公藤多苷作为阳性对照药物,过表达蓬乱蛋白1(Dvl1)后加入闹羊花毒素Ⅲ研究其作用机制。细胞增殖毒性检测法(CCK-8法)检测细胞活力,蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(Bax)、无翅型MMTV整合位点家族成员1(Wnt1)、Dvl1、β-连环蛋白(β-catenin)的表达量,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测Wnt1、Dvl1、β-catenin mRNA水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-4、CC趋化因子配体2(CCL2)、CC趋化因子配体5(CCL5)的含量。结果RA细胞模型构建成功,随着闹羊花毒素Ⅲ浓度的增加,RA-FLS细胞增殖减缓(P<0.05),凋亡增加(P<0.01);闹羊花毒素Ⅲ与雷公藤多苷降低了RA-FLS细胞中IL-6、IL-8、CCL2、CCL5并且增加了IL-10、IL-4的含量(P<0.05);降低了Wnt1、β-catenin、Dvl1蛋白与mRNA的表达量(P<0.01)。闹羊花毒素Ⅲ可以逆转由过表达Dvl1所造成的RA-FLS细胞增殖的增加(P<0.05)、促炎因子(IL-6、IL-8)与趋化因子(CCL2、CCL5)的增加(P<0.05),并逆转Wnt通路中Wnt1,Dvl1,β-catenin蛋白与mRNA表达的增加(P<0.01)。结论闹羊花毒素Ⅲ通过调控Wnt1/Dvl1/β-catenin通路影响TNF-α诱导的RA-FLS细胞增殖凋亡及炎症因子等的变化,可能通过这种机制治疗RA。

蛋白酶体-C2亚基基因在烫伤脓毒症大鼠心肌内的表达及意义

目的 探讨烧伤脓毒症时动物心肌内蛋白酶体核心亚基C2亚基m RNA表达及蛋白降解的变化及意义。方法 雄性Wistar大鼠4 5只,随机分为烫伤组、脓毒症组及对照组。烫伤组大鼠使用沸水致背部30 %总体表面积 度烫伤;脓毒症组大鼠用同样方法烫伤后,立即腹腔注射内毒素(6 m g/ kg)制成烫伤脓毒症大鼠模型。通过高效液相荧光法检测心肌内三甲基组氨酸(3MH)的含量,用核糖核酸印迹杂交(Northern杂交)检测心肌内蛋白酶体C2亚基m RNA表达的变化。结果 脓毒症大鼠烫伤后2 h和6 h,单位心肌内3MH含量较对照组和烫伤组均显著升高(P均<0 .0 1) ;烫伤组大鼠伤后2 h与对照组比较差异无显著性(P>0 .0 5 ) ,而伤后6 h较对照组显著升高(P<0 .0 1)。脓毒症大鼠伤后2 h和6 h心肌内蛋白酶体C2亚基m RNA表达较对照组和烫伤组均显著升高(P均<0 .0 1) ,烫伤组大鼠伤后2 h和6 h较对照组也均显著升高(P均<0 .0 1)。结论 严重烫伤特别是合并内毒素攻击后,早期动物心肌细胞内泛素蛋白酶体途径活性呈持续增强现象,蛋白降解率显著增加。这可能是烧伤脓毒症时心功能异常的蛋白代谢机制。

包裹外毒素Ⅲ的抗CD19脂质体靶向杀伤人B淋巴瘤

目的利用包裹绿脓杆菌外毒素单元Ⅲ的抗CD19-免疫脂质体于体内外靶向杀伤淋巴瘤细胞。方法通过结合实验,验证抗CD19免疫脂质体对B淋巴瘤细胞具有特异结合能力。运用体外细胞毒实验(MTT)方法,检测外毒素单元Ⅲ及免疫脂质体包裹的单元Ⅲ对淋巴瘤细胞的杀伤作用。采用小鼠荷人B淋巴瘤模型,于体内运用免疫脂质体包裹的单元Ⅲ靶向杀伤肿瘤细胞。结果在去除外毒素单元Ⅰ和Ⅱ后发现,单元Ⅲ的细胞毒作用消失。当将其包裹入耦联抗CD19的免疫脂质体后发现,脂质体明显提高单元Ⅲ的细胞毒性。用此脂质体治疗,可延长荷B淋巴瘤小鼠的寿命。结论耦联抗CD19的免疫脂质体可特异性地识别B淋巴瘤细胞,并作为良好载体将无毒绿脓杆菌外毒素单元Ⅲ带入细胞。外毒素单元Ⅲ的此种剂型,可成为杀灭肿瘤细胞的有效物质。