数字液滴PCR图像的荧光信息提取

针对数字液滴聚合酶链式反应(droplet digital Polymerase Chain Reaction,ddPCR)核酸检测中数字聚合酶链式反应由液滴数量多、尺寸小、排列紧密、荧光强度不均匀而导致的液滴难以计数问题,提出一种图像处理方法,基于灰度遍历法采集图像的信息,通过微分分析法对液滴进行分类和计数,可准确采集ddPCR实验的图像信息。通过卷积算法去除图像中的噪声,使用灰度分布均衡化法增强图像的对比度。以灰度遍历的方式将图像在逐个阈值下二值化,并以几何条件为限制统计液滴数量。通过微分分析法对数据进行分析,得出荧光液滴与全部液滴的计数结果。在以人类gDNA(genomic DNA)为检测样本的ddPCR实验中,该算法的平均检测准确率为99.36%,与商用仪器算法和同类算法相比分别提高了2.24%,2.53%。该方法为ddPCR实验提供了可靠的检测结果,可更好地适用于ddPCR实验。

小反刍兽疫病毒液滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。

液滴数字PCR在乳腺癌精准治疗中的应用

在精准医学大背景下,分子分型指导下的乳腺癌个体化治疗虽已成为常态,但仍需不断寻求更加优质高效的精准治疗方案。液滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)在稀有基因突变检测、拷贝数变异检测以及与下一代测序技术相整合等方面,较传统的实时荧光定量PCR表现出明显的优势。本文针对dd PCR平台在不同乳腺癌亚型中的应用,以及对dd PCR技术助力下的乳腺癌的研究进行综述。

液滴数字PCR在肿瘤个体化治疗方面的应用

个体化治疗可以提高肿瘤病人的生存质量和生存时间,而肿瘤患者基因状态指导个体化用药,商业化的液滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)已经上市,并且可以在一个样本中对核酸精确定量。它是通过将模板稀释到20000个水包油微滴实现的,每个液滴可被微滴阅读器判定为阳性或阴性,因此某个等位基因的浓度可以被精确计算,它能够用于检测稀有突变体以及定量。与传统的实时PCR(q PCR)相比,dd PCR具有许多优点,尤其是灵敏且能够获得精确定量,例如,可以检测石蜡包埋样品中基因组扩增;可以以非侵入性的方式通过体液,如血液和痰来检测肿瘤基因突变;也可通过dd PCR检测拷贝数变异,从而研究其与癌症的相关性。

微流控液滴生成技术及液滴数字PCR系统的研究进展

数字PCR作为一种新型核酸分析方法,能对样品中目标核酸分子进行绝对定量,具有极高的检测灵敏度和突出的抗背景序列对靶序列的竞争抑制能力。凭借这些优势,数字PCR在癌症标志物检测、无创产前检查等领域具有广阔的应用前景。液滴数字PCR技术将PCR反应体系稀释并分散至大量液滴中,使液滴成为最多只包含单核酸分子的独立反应单元后进行PCR扩增和检测。目前液滴数字PCR分析系统大多采用微流控芯片生成液滴,芯片结构复杂、加工困难、价格高昂,这些因素在一定程度上限制了其推广应用。探索能快速生成大规模液滴的方法对促进液滴数字PCR系统的发展具有重要意义。本文综述了微流控液滴生成技术和液滴数字PCR系统的研究进展,对膜乳化法、微流控芯片法和毛细管法进行了分类介绍并总结了它们的优缺点,介绍了微流控液滴数字PCR系统和商业化产品,并对液滴数字PCR技术的发展前景进行了展望。

液滴式数字PCR检测晚期非小细胞肺癌血液EGFR突变的应用价值

目的 采用液滴式数字PCR(ddPCR)法检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血循环肿瘤DNA(ctDNA) EGFR 基因突变的情况,探讨试剂盒的性能、检测结果的可靠性和准确性以及ddPCR法在外周血ctDNA中的应用价值。方法 使用标准突变比例的模拟cfDNA样本ddPCR法对试剂检测限、准确性、特异性、精密度、抗干扰能力等指标进行分析及评价;使用ddPCR法检测262例NSCLC患者外周血ctDNA,随机选取30例样本同时进行Super-ARMS法检测,并从方法学标准化和检测结果准确性两方面进行统计学分析。结果 检测试剂在检测限以上的准确性、特异性均为100%,定量精密度(突变比例对数的绝对值变异系数 CV )<5%,关键环节质量控制各主要参数的相关性和线性关系均符合要求;Super-ARMS和ddPCR法同步检测30例NSCLC患者外周血ctDNA的结果具有较好的一致性( Kappa =0.783, P =0.000)。结论 ddPCR法灵敏度高,可绝对定量,是血液检测的有效的方法,但其在检测过程中存在较多对检测结果产生影响的环节,故而检测方法标准化至关重要。

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较,探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标,根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针,建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同,约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10^(4)copies/μL~1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%~62.96%),重复性越差;实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%~4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论和实时荧光定量PCR相比,液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势,后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、精密度及特异度等方面进行讨论。

液滴式数字PCR检测尿路上皮癌患者尿cfDNA中FGFR3基因S249C突变的临床应用价值

目的:通过非侵入性方式提取尿路上皮癌(UC)患者尿游离DNA(cfDNA),使用液滴数字PCR(ddPCR)检测尿cfDNA中成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因S249C位点突变,辅助尿脱落细胞学检查提高UC的诊断效能。方法:收集27例UC患者尿液并提取尿cfDNA,采用ddPCR检测尿cfDNA中FGFR3 S249C突变情况。应用受试者工作特征曲线(ROC)评价尿cfDNA中FGFR3 S249C突变对于尿脱落细胞学诊断不明确UC患者的诊断效能。结果:UC患者尿cfDNA中FGFR3 S249C突变的检出率为25.9%(7/27)。按尿液细胞学巴黎报告系统(TPS)分类,FGFR3 S249C突变在高级别尿路上皮癌(HGUC)中检出率为18.8%(3/16),可疑高级别尿路上皮癌(SHGUC)中为50%(4/8),未见高级别尿路上皮癌(NHGUC)中为0(0/3)。FGFR3 S249C在非浸润性UC中的突变率为25.0%(1/4),在浸润性UC中为31.6%(6/19)。在尿脱落细胞学诊断为SHGUC的样本中使用ddPCR检测出的FGFR3 S249C突变对于UC有50%(4/8)的检出率,且ROC曲线下面积为0.781,95%CI(0.407,1.000),在UC诊断中起到良好的辅助作用。结论:使用ddPCR检测尿cfDNA中FGFR3 S249C突变作为一种非侵入性的检测方式可以辅助提高尿脱落细胞学诊断不明确样本的诊断效能。

基于计算机视觉的液滴图像拼接与识别算法研究

液滴微流控技术是近来年生物医学领域新兴的生化分析手段,要提高其检测的灵敏度和特异性,对微流控芯片中的目标液滴实现高通量、高精度检测与计数具有重要的研究意义。提出一种低复杂度、低成本、高灵敏度的基于计算机视觉的荧光液滴图像与明场液滴图像拼接与识别方法,可以实现对扩增后的液滴芯片扫描拍照后的拼接,并且通过轮廓检测以及轮廓筛选,对拼接后的图像进行准确的液滴识别。实验表明,该算法对荧光和非荧光液滴的识别率均达到99.2%以上,与较高复杂度的基于分水岭分割法相比更加简单可靠,可达到与分水岭算法相同的识别正确率,具有一定优越性,能在高通量液滴检测领域得到较好的应用。

猴痘病毒微液滴数字PCR检测方法的建立

目的建立一种用于猴痘病毒(mpox virus)核酸检测的微液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法设计靶向猴痘病毒F3L基因的特异性引物和探针,建立猴痘病毒核酸的ddPCR检测方法,对ddPCR的最适反应条件进行优化,并对ddPCR的特异性、灵敏度以及重复性进行检测。进一步对人脓拭子临床样本进行检测,对ddPCR方法检测临床样本的能力进行评价。结果对ddPCR反应温度和引物探针浓度进行优化,建立猴痘病毒ddPCR检测方法,该方法最低检测限可达2拷贝/μl,与其他8种病毒无交叉反应。对10份人皮肤脓液拭子临床样本中的猴痘病毒进行检测,ddPCR方法检测到5份阳性样本,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法检测到4份阳性样本。结论建立的猴痘病毒的ddPCR检测方法快速、特异、灵敏度高,用于临床样本中猴痘病毒检测。

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。

液滴数字PCR在乳腺癌精准治疗中的应用效果观察

目的观察液滴数字PCR在乳腺癌精准治疗中的应用效果。方法选取2015年1月—2017年6月收治的乳腺癌患者80例,随机分为对照组与观察组,各40例,对照组给予传统实时荧光定量PCR诊断方法,观察组给予液滴数字PCR诊断,对比两种方法的诊断特异度、灵敏度,并观察两组Brcal基因表达与β_2-微球蛋白水平。结果观察组的特异度、灵敏度明显高于对照组,液滴数字PCR的特异度、灵敏度明显高于传统PCR检测方式;观察组的Bmal基因表达及β_2-徽球蛋白水平明显低于对照组。结论使用液滴数字PCR可精准的诊断乳腺癌,提升治愈率,改善患者生活质量。

牛结节性皮肤病病毒(NMG株)基因组DNA标准物质的研制

为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因的拷贝数以评估该标准物质的均匀性、稳定性并与9家实验室协作标定;进一步采用qPCR方法对该标准物质试用。结果显示,本研究制备的标准物质不存在外源病毒污染;组内和组间无显著性差异,均匀性好;标准物质于-20℃稳定保存6个月,4℃稳定保存7d,25℃稳定保存24 h;标准物质ORF101基因最终定值为(8.6±1.3)×10~3拷贝/μL;可以用于qPCR检测。综上,该标准物质定值准确,均匀性好,不仅可以用于LSDV核酸检测相关实验的质量控制、仪器校准、检测方法评价,还可为研制体外诊断试剂提供物质基础。

口咽鳞状细胞癌中HPV DNA检测的研究进展

随着世界范围对烟草、酒精危害认识的增加,烟草、酒精等高危因素引起的口咽鳞状细胞癌(OPSCC)的发病率在世界范围内有所下降,但人乳头瘤病毒(HPV)相关性OPSCC的发病率在逐渐上升,其造成的疾病负担也日益加重。目前已经开发了几种用于检测OPSCC中HPV DNA的方法,每种方法在灵敏度、特异度和操作难度上有着各自的优缺点。本文总结了目前具有前景的检测OPSCC中HPV DNA的方法,并对目前的研究进展进行综述。

一例TSC2基因低比例突变嵌合体基因学分析

目的:对一例临床表现不典型的结节性硬化症(TSC)患者进行基因突变分析以明确诊断。方法:收集一例临床上拟诊TSC的患者及其父母的外周血,通过全外显子组测序技术对先证者TSC1和TSC2基因的全部外显子及其侧翼序列进行测序,确定候选致病突变位点,同时对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序验证,并用液滴数字PCR技术确定先证者体细胞中该突变嵌合比例。结果:先证者的TSC2基因第11号外显子存在c.1096G>T(p.E366*)杂合无义突变,为微小突变峰,突变比例未高于其突变阈值,不排除嵌合体的可能。液滴数字PCR结果提示,先证者为c.1096G>T点突变嵌合体,嵌合比例为14%。结论:先证者TSC2基因发生体细胞镶嵌突变,c.1096G>T可能是该TSC患者的致病原因。液滴数字PCR有助于体细胞镶嵌突变嵌合体的确诊。

父亲FOXF1基因体细胞-生殖腺嵌合变异导致患儿死亡1例的遗传学分析

目的探讨1例出生后2 d死亡的肺泡毛细血管发育不良伴肺静脉错位(ACD/MPV)患儿的遗传学特征及其死亡原因。方法选取2022年9月就诊于南通大学附属妇幼保健院的1例ACD/MPV患儿作为研究对象。采集患儿的临床资料。应用全外显子组测序(WES)技术对患儿皮肤组织进行基因检测,针对候选致病变异,进行Sanger测序家系验证。应用液滴数字PCR(ddPCR)技术检测该变异在患儿父亲不同胚层来源标本中的嵌合比例。结果患儿出生后2 d因"低氧血症和呼吸窘迫"死亡。WES结果显示患儿携带FOXF1基因c.433C>T杂合变异,既往未见报道。Sanger测序验证患儿存在该变异,母亲该位点为野生型,父亲外周血样中该位点可见微小变异峰。ddPCR提示其父亲精液中c.433C>T变异嵌合比例为27.18%,源于3个胚层的组织中该变异嵌合比例为11%~28%。结论本研究患儿携带的源自其嵌合变异父亲的FOXF1基因c.433C>T杂合变异可能为导致该患儿死亡的遗传学病因。ddPCR为检测变异嵌合的有效手段。