数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测领域中的研究进展及标准化现状

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是一种新型核酸扩增技术,无需借助内参基因和标准曲线,通过极限稀释和泊松分布统计即可实现核酸单分子层面的绝对定量分析,具有高灵敏度、高精确度和高耐受性等技术优势,在食品安全核酸检测领域具有极大的发展潜力。本文介绍了dPCR的技术原理、优缺点及商业化平台,综述了dPCR在食源性致病菌检测、动物和植物源性成分检测、转基因成分检测和食源性病毒检测等领域的研究进展及标准化现状,并分析了该技术存在的技术难题和未来发展方向,以期为dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用推广和标准制定提供研究思路。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全核酸检测中的研究进展

数字聚合酶链式反应(Digital Polymerase Chain Reaction,dPCR)技术是一种新兴的核酸绝对定量分析技术,无须标准品和绘制标准曲线,通过极限稀释样品和泊松概率分布原理就可以精准检测样本初始的DNA拷贝数,具有特异性强、灵敏度高和重复性好的特性,在食品安全核酸检测领域具有较好的发展潜力。本文介绍了dPCR技术的基本原理和特点,分析了dPCR技术在食品安全核酸检测领域的研究现状,并对其在食品安全中的应用前景进行展望,以期为促进dPCR在食品安全核酸检测领域中的应用提供一定参考。

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法基于马铃薯内参UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量限、检测准确度进行评估。结果该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于0.86%~22.90%,线性决定系数r^(2)>0.99;品系特异性基因的定量限为3拷贝;不同浓度样品EH92-527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和–1.31。结论方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。

微滴式数字聚合酶链式反应在血流感染快速诊断中的性能评价及应用

目的使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能,并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患者的血液样本,同时采用ddPCR和血培养2种方法测定患者血液标本的病原体。结果ddPCR血流感染病原体检测的平均检测时间为3.5 h,能够同时检测十几种常见病原体,ddPCR血流感染病原体检测试剂盒的符合率、特异度、精密度、最低检测限均满足临床要求。疑似血流感染的74例患者中,采用ddPCR方法检测的阳性率为64.86%,采用血培养检测的阳性率为40.54%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ddPCR可快速﹑批量﹑高效地检测血流感染常见病原体,检测性能可以满足临床需要,血培养联合ddPCR技术检测血流感染有利于临床血流感染患者的早期快速诊断。

冬虫夏草微滴式数字聚合酶链式反应定量检测方法的建立及应用

目的建立一种定量检测冬虫夏草菌的微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)检测方法,探讨其定量检测冬虫夏草的可行性。方法使用冬虫夏草菌特异性引物和探针建立ddPCR检测方法,对冬虫夏草及其常见伪品进行鉴别,对其特异性和自制混伪品进行检测和评估,并采用该方法对市场流通的冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分进行检测。结果ddPCR检测方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性,且在掺伪0%~70%范围内定量检测的准确性高;此外,对冬虫夏草及其制剂市售样品的检测结果显示,该方法可用于冬虫夏草的定量检测。结论ddPCR检测方法可成功检测市售冬虫夏草产品中的冬虫夏草菌成分,具有市场应用价值,可为含冬虫夏草成分的保健食品和药品提供定量和鉴伪检测依据。

数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。

微滴式数字聚合酶链式反应精准定量检测羊肉中掺杂猪肉

以羊和猪的单拷贝持家基因DNA复制蛋白A1为靶基因设计合成了适用于微滴式数字聚合酶链式反应的特异性引物和探针,通过理论推导获得了单位质量两种肉基因拷贝数之比的固定值,并进行了验证,据此将样品中羊肉和猪肉的拷贝数转换为相对质量分数,从而建立了羊肉中掺杂猪肉的精准定量检测方法。该方法可以很好地应用于羊肉中掺杂猪肉的含量检测,猪肉的最低定量限为1%,在5%~80%范围内绝对误差小于±1.30%,相对误差小于±10%,定量结果准确、重复性高,可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术参考。

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应（ PCR）技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比，数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片，加工过程复杂且价格高昂。近年来，液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中，它可以在短时间内产生10^2-10^7个微液滴，每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后，通过对单个微液滴的观察计数，就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用，以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。

常见转基因大米数字聚合酶链式反应多重定量检测方法研究

目的建立4种转基因(geneticallymodified,GM)大米成分多重定量检测方法,解决混合转基因产品和多品系杂交的多价转基因产品高通量精准定量难题。方法采用Raindrop微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对4种常见转基因大米TT51-1、克螟稻、科丰6号、M12品系特异性基因和大米蔗糖磷酸合成酶基因逐一进行拷贝数分析,并将其转化为含量百分比。结果转基因含量在0.1%~100.0%范围内的4个品系转基因大米混合样品的定量体系线性关系良好,标准曲线r2值均在0.99以上,定量相对灵敏度可达0.1%,相对误差和相对标准偏差值均小于25%,定量准确性和精密度符合国际通用要求。结论本研究成功建立了4种常见转基因大米成分的多重定量检测方法,解决了常规方法一次只能定量分析单一样品的缺点,为大米、稻谷及其初加工产品中多种转基因成分的高效定量提供了新的技术手段。

一种用于核酸高灵敏检测的液滴式数字聚合酶链式反应芯片

为了实现对核酸的高灵敏度检测,构建了一种新型的液滴式数字聚合酶链式反应(dd PCR)芯片.该芯片由产生液滴的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模块和储存液滴的玻璃腔室构成.实验结果表明,该芯片可以在25 min内产生2×106个直径为20μm的微液滴(体积4.187 p L).利用该芯片定量检测了表皮生长因子受体(EGFR)基因第19号外显子,在DNA浓度为106~101copies/μL范围内呈现良好的线性关系(R2=0.9998);在浓度为106copies/μL的19号外显子野生型DNA中检测105~100copies/μL的突变型DNA,其检测敏感度可达到0.0001%.该方法在同一芯片上实现了液滴产生、核酸扩增和荧光信号读取的功能,在核酸绝对定量及痕量突变基因的检测中具有潜在应用前景.

智能数字聚合酶链式反应系统的开发与应用验证

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)技术可以针对低浓度的目标核酸分子实现精确的绝对定量检测,在各类疾病的检测与治疗方面有着极大应用价值.针对目前商业数字PCR仪造价昂贵、体积庞大等缺点,基于智能手机与微流控芯片,设计开发了一种低成本、高集成的智能数字PCR设备.介绍了硬件系统的制作以及整机的整合搭建过程.采用PID算法,结合温控电路与半导体制冷片等硬件,进行了PCR温度循环的精准控制.最后,采用自适应阈值分割法对采集到的荧光图像进行了处理,并依据泊松分布的规律对统计结果进行了校正,完成了对PCR反应后采集到荧光图像的结果分析与检测.

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素(growth hormone,GH)基因和猪的朊蛋白(prion protein,PRNP)基因2种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明:该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20份牛肉制品中,4份检出猪肉成分,其中3份的相对含量为29.19%～98.15%,1份为0.12%(低于本方法检出限5%)。因此,dd PCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。

微滴式数字聚合酶链式反应在食品安全检测领域的应用

微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文重点论述了ddPCR法的技术原理、优势以及在食源性致病微生物定量检测、转基因成分分析、食品源性成分检测等食品安全检测领域的应用研究进展情况。

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR),以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量(x1)与基因拷贝数浓度(y 2)之间的关系式为:鸡:x1=n×y2/273.946-n/886.557+0.216;猪:x1=n×y2/64.950+n/60.644+0.215;牛:x1=n×y2/62.839+n/12.646+1.218(n为稀释倍数);基于建立的ddPCR方法对64份市售不同种类香肠样品进行检测,在1份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法。结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性成分,灵敏性为11.1 copies/μL;根据鸭肉粉质量(mg)与DNA质量浓度(ng/μL)、DNA质量浓度(ng/μL)与鸭GH基因拷贝数浓度(copies/μL)之间的线性关系,建立鸭肉粉质量(x)与鸭GH基因拷贝数浓度(y)之间的关系式为x=(n×y)/725.046-n/1317.06+0.153;模拟混合样本中鸭肉粉质量分数5%-100%时,鸭源性成分检测的绝对误差均小于±1.52%,变异系数均小于10.38%,回收率为98.35%~125.32%;在88份商品化肉制品中,11份肉制品中检出鸭源性成分,检出率为12.5%,且鸭源性成分含量为18.6%~87.4%。本研究所建立的鸭源性成分ddPCR方法有较好的准确性和较强的适用性,能够应用于肉制品中鸭源性成分的定量检测。

基于数字聚合酶链式反应的生物芯片分析仪的审评要点

数字聚合酶链式反应(dPCR)已被广泛用于分子诊断的各个方面。基于dPCR技术的生物芯片分析仪通过采集微滴荧光信号,对载有处理后核酸样本的生物芯片进行数据处理和分析,从而实现对核酸的精准绝对定量。现针对医疗器械注册申报材料提出技术审评关注点,以评价生物芯片分析仪安全有效性,以期对该类产品注册申报和技术审评提供参考。

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术检测布鲁氏菌病患者血液中布鲁氏菌核酸的研究

目的本研究旨在建立一种基于微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)的检测方法,能够实现对布鲁氏菌病(布病)患者血液中布鲁氏菌核酸的定量与精准检测。方法以布鲁氏菌Bcsp31基因为靶基因,设计引物与探针并构建pUC57-Bcsp31重组阳性质粒,评价ddPCR方法检测布鲁氏菌的灵敏度、重复性与特异度。此外,收集疑似布病患者血液120份,采用ddPCR方法对样本中布鲁氏菌DNA载量进行定量检测。结果本研究建立的ddPCR检测布鲁氏菌的方法具有很高的灵敏性,最低检出限为100拷贝/μL,并且对布鲁氏菌的检测呈现出良好的特异性与准确性。120份血液样本中,ddPCR方法检出阳性103份,实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法检出阳性52份。105份抗体阳性样本中,ddPCR方法与qPCR方法分别检出阳性93份和51份,阳性率分别为88.57%和49.52%。15份抗体阴性样本中,两种方法分别检测出阳性12份和1份。结论本研究建立了一种基于ddPCR方法的高灵敏度、高特异度的检测布鲁氏菌的方法,能够实现布病患者血液样品中布鲁氏菌核酸的定量与精准检测。尤其对于抗体阴性的疑似患者早期布病筛查具有重要意义。

微滴式数字聚合酶链式反应技术在新型冠状病毒检测中的应用与评价

目的 分析微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)对新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome corona virus-2, SARS-CoV-2)的核酸检测结果,并与实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测结果相比较,评价其检测优缺点,为优化新型冠状病毒的核酸检测方案提供数据支持。方法 根据中国疾病预防控制中心公布的SARS-CoV-2特异性引物探针,设计针对SARS-CoV-2的ddPCR检测方法,选取1份样本梯度稀释后进行灵敏度试验;选取季节性H3N2流感病毒等6种呼吸道病毒核酸阳性的样本与SARS-CoV-2阳性样本进行特异性试验;选取5份SARS-CoV-2阳性样本进行重复性试验,并选取SARS-CoV-2阳性30份、阴性20份样本进行多临床样本检测,与qRT-PCR检测结果进行分析比较。结果 ddPCR法能特异检出SARS-CoV-2,并直接得到样本靶基因的原始拷贝数,实现精准定量;对梯度稀释阳性样本灵敏度检测显示,qRT-PCR在样本10-5稀释度部分检出靶基因,10-6稀释度未检出靶基因,而ddPCR在样本10-5、10-6稀释度均全部检出靶基因,ddPCR的检测下限相对qRT-PCR结果有2个数量级的提升,灵敏度高于qRT-PCR;两种方法重复性实验结果比对中,ddPCR变异系数为1.266%~11.814%,低于qRT-PCR的1.729%~26.174%,重复性高于qRT-PCR;对50份临床样本检测比较中,30份新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)确诊病例阳性样本,两种方法均能成功检出SARS-CoV-2,20份COVID-19阴性样本经两种方法检测,结果均为阴性,检测结果符合率为100.00%(50/50)。结论 ddPCR法对SARS-CoV-2能精准定量,特异性强,且灵敏度和重复性均高于qRT-PCR,但也存在一定检测局限性,更适合低载量样本的检测。在实际检测中,可将两种方法合理结合,提高检测准确性。

基于微滴式数字PCR技术检测树莓制品的定量分析方法

为了检验树莓制品中是否掺杂其他成分,建立了微滴式数字聚合酶链式反应(Droplet Digital PCR,ddPCR)技术定量检测树莓成分的检验方法。结果表明,实验建立的树莓掺假模型的检测结果准确,为检测市售树莓制品中是否掺假提供了一种新的、更加精确的定量手段。

微滴数字PCR技术在多拷贝木聚糖酶酿酒酵母工程菌筛选中的应用

为获得高产木聚糖酶酿酒酵母工程菌,利用rDNA整合法构建木聚糖酶酿酒酵母整合表达载体,实现木聚糖酶基因的多拷贝表达,并利用微滴数字聚合酶链式反应技术对转化子拷贝数进行检测,分析木聚糖酶基因拷贝数与酶活力之间的关系。结果表明:利用rDNA整合法获得了10株不同拷贝数木聚糖酶酿酒酵母工程菌,对其酶活力进行测定,发现当拷贝数小于9时,菌株产酶能力随拷贝数增加而增强,9拷贝数时菌株产酶能力最强,酶活力为308 U/m L,超过9拷贝,产酶能力降低。