尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为102 copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR有优势。使用建立的多重ddPCR方法对14份P3实验室中的样品进行实验室样品检测,样品检测符合率达到100%。成功建立了能够同时检测用于鉴别野毒株感染与疫苗株的荧光定量PCR和微滴式ddPCR方法。

小反刍兽疫病毒液滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为实现小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的快速、准确、定量检测,以国内PPRV Clone 9疫苗株N基因为靶位点设计特异性引物及探针,建立了液滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法,并对其特异性、敏感性及重复性进行评价。将所建立的ddPCR方法与实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,qPCR)方法的灵敏度进行比较分析并应用于PPRV(Clone 9株)核糖核酸标准物质的定量。结果显示,所建立的ddPCR方法特异性好,仅PPRV检测结果为阳性,其他羊源病毒类生物制品及毒种检测结果均为阴性;敏感性高,基因拷贝数检出限度为4.33拷贝/μL,比qPCR方法的灵敏度(57.3拷贝/μL)高10倍;重复性好,重复性试验的变异系数为1.8%;定量准确,具有一定资质的9家单位各组测量数据组间变异系数小于5%。试验建立的ddPCR方法能够有效地对PPRV核酸进行快速检测,为PPRV的诊断及绝对定量提供了有效方法。

基于drop-off ddPCR方法检测急性髓系白血病C-KIT基因N822位点突变及其临床应用

目的:建立急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者C-KIT基因N822位点突变的drop-off微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法,并评价其临床应用价值。方法:针对C-KIT基因第17外显子设计一对引物及探针,优化drop-off ddPCR反应条件及体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,使用所建立的方法对140例已行Sanger测序的AML初诊患者骨髓标本进行检测,并用二代测序(next generation sequencing, NGS)验证结果;用drop-off ddPCR对3例阳性患者化疗后C-KIT突变频率进行动态监测。结果:drop-off ddPCR检测C-KIT基因N822位点突变的最适退火温度为54℃,空白检测限为1.62拷贝数/μL,最低检测下限为10.12拷贝数/μL,线性良好。140例AML初诊患者样本中Sanger测序检出2例阳性(1.4%),而ddPCR共检出突变7例(5.0%),突变频率为0.29%~7.41%;进一步应用常规NGS方法对ddPCR阳性样本进行验证,共检出阳性3例(2.1%),等位基因频率为1.26%~8.00%。动态监测3例阳性患者C-KIT突变频率,结果显示治疗达完全缓解时C-KIT突变频率明显下降甚至降低至0。结论:本研究建立了检测C-KIT基因N822位点突变的drop-off ddPCR技术,具有良好的方法学检测性能,其灵敏度高于Sanger测序和NGS,有望用于阳性患者缓解后的可检测残留疾病监测及治疗指导。

血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×10^(7)拷贝/μL~1.43×10^(0)拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×10^(2)拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍。重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%。对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为89.83%,总符合率为91.42%。上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段。

SARS-CoV-2 Omicron变异株多重微滴式数字PCR定量方法的建立及应用

【目的】为建立精准、高效的多重微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量分析检测方法,开发可同时鉴别新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因的检测体系,提高病毒性传染疾病的诊断效率及传播风险监测能力。【方法】通过筛选保守基因序列并设计特异性引物与探针,优化反应体系和扩增程序,对该方法的特异性、灵敏度及稳定性进行评价。以临床样本为实验材料,利用建立的ddPCR方法进行检测和验证,确定阳性检出率。【结果】多重ddPCR反应体系中,各对引物探针对目的片段均能有效扩增,SARS-CoV-2 ORF1ab基因、N基因、E基因以及Omicron变异株S基因灵敏度检测下限分别为0.59、0.68、1.44、1.03 copies/μL。在20份临床样本的核酸检测中,共检出16份阳性样本,阳性率达80%(16/20),经荧光定量PCR方法复测符合率一致。【结论】研究建立的多重ddPCR方法特异性强、灵敏度高,可实现对临床样本中微量新冠病毒的精确定量检测。

微滴式数字PCR定量检测伯氏考克斯氏体方法的建立及应用

为建立伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii,Cb)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)检测方法,研究以Cb IS1111基因为靶基因,并针对基因保守区域设计了特异性引物和探针,以使反应的条件更加完善,从而构建了ddPCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性作出了评估。结果显示,所采用的ddPCR方法最低可检测的浓度为0.52 copies/μL,敏感性较高;与动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、土拉杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌无交叉反应,特异性强;组内重复和组间重复变异系数均小于10%,重复性好。使用本实验建立的方法检测了42份疑似感染的临床样品,检测结果与荧光PCR鉴定结果一致。表明建立的ddPCR方法的特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,可用于Cb的快速检测和精准定量,对Cb感染的防控具有重要意义。

数字PCR技术在感染性疾病中的应用进展

数字PCR是一种具有广泛应用前景的、可绝对定量的核酸检测新技术,与实时荧光PCR相比具有高灵敏度和精确度上的优势。近年来,数字PCR已广泛应用于临床检测领域,特别是病原微生物的检测中,为相关疾病的早期诊断、监测预警、疗效评估等提供了量化指标依据。基于此,该文对数字PCR的技术原理、优势及其在感染性疾病中的应用进行综述,以期为数字PCR更好地用于感染性疾病提供参考借鉴。

微滴数字PCR在重症急性胰腺炎疑似血流感染病原学诊断中的应用

目的探讨微滴数字聚合酶链反应(ddPCR)在重症急性胰腺炎(SAP)合并疑似血流感染(BSI)病原学诊断中的价值。方法选取2022年7—9月某院重症医学科收治的SAP患者,在疑似BSI发作时同步采集静脉血进行ddPCR检测和血培养(BC)及药敏试验(AST),记录两种检测方法的耗时,比较ddPCR与BC的检测结果,计算ddPCR的病原学诊断效能,并探讨ddPCR检测病原菌载量值与感染指标水平的相关性。结果共纳入22例患者,采集52份静脉血标本进行检测,BC阳性17份(32.7%),检出病原体29株;ddPCR阳性41份(78.8%),检测出病原体73株。ddPCR耗时低于BC[(0.16±0.03)d VS(5.92±1.20)d,P<0.001]。在ddPCR检测范围内,以BC为金标准,ddPCR检测的灵敏度和特异度分别为80.0%、28.6%;联合检测前1周内非血标本微生物证据综合判定BSI,ddPCR检测的灵敏度和特异度分别提高至91.9%、76.9%。ddPCR耐药基因检测中,19份检出bla KPC,9份检出bla NDM/IMP,6份检出V an A/V an M,5份检出mec A。相关性分析显示病原菌载量值与C反应蛋白、降钙素原水平呈正相关(r分别为0.347、0.414,均P<0.05)。结论ddPCR作为一种辅助BC诊断BSI的检测方法具有灵敏度高、耗时低等优势,值得进一步探讨其在临床中的应用。

数字PCR技术在肿瘤液体活检甲基化检测中的应用及挑战

数字PCR技术在液体活检甲基化标志物的检测中展现出其独特的优势,高灵敏性与精确的定量能力使其成为肿瘤早期诊断和监测治疗效果的有力工具。通过对各类生物样本中的甲基化状态进行高通量、高精度的分析,数字PCR提升了肿瘤早期发现的概率,并为个性化治疗方案的制定提供了重要依据。尽管数字PCR技术具有上述优点,但其在甲基化检测中的应用仍存在一些挑战。如何确保检测的精度和重复性,提升样本处理流程的效率,以及完善数据解析和结果评估体系仍面临挑战。此外,建立与国家标准相匹配的行业规范,亦是推广数字PCR技术广泛应用于临床的关键。随着技术的不断进步和完善,数字PCR有望成为液体活检中甲基化检测的“金标准”,为癌症患者提供更加准确、快捷的诊断手段,从而提高肿瘤诊治效率,改善患者预后。

病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字PCR阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

微滴式数字PCR技术在动物疫病检测中的应用研究进展

数字PCR(dPCR)技术是最近发展起来的第三代PCR技术,其中微滴式数字PCR(ddPCR)技术具有敏感性高、耐受性强,准确性和重复性好,可实现不依赖标准曲线即可对样本目标核酸进行绝对定量的优点,得到研究者的广泛关注。ddPCR技术凭借诸多优势,近年来在动物疫病病原检测领域得到了飞速发展,已被成功应用于病毒、细菌、寄生虫以及支原体、衣原体等多种病原的检测,尤其为低丰度病原调查、实验室检测和病原分型鉴定提供了强有力的技术支撑。本文综述了ddPCR技术的基本原理及其在动物疫病诊断中的应用和发展前景,以期为ddPCR技术在兽医实验室动物疫病诊断方面的推广提供参考。

利用微滴数字PCR仪定量检测贝类中两种弧菌方法的建立

建立贝类中霍乱弧菌和副溶血性弧菌微滴数字聚合酶链式反应快速精准定量检测方法,评价其可行性。采用SN/T 2425-2010和SN/T 2424-2010的引物和探针,建立双重微滴数字PCR反应体系。霍乱弧菌和副溶血性弧菌双重微滴数字PCR的最低检测限度分别可达到2.9 copies/μL和1.7 copies/μL,相当于1×10^(5)CFU/mL纯菌液,所建立的双重微滴数字PCR检测方法具有特异性和灵敏性,重复性试验结果也很稳定,不与其他常见病原菌发生交叉反应。本研究建立的双重微滴数字PCR方法可有效定量检测贝类样品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌。

幽门螺杆菌毒力基因数字PCR检测体系的建立

建立幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)毒力基因数字PCR检测体系,为Hp诊疗提供一个精准、灵敏的毒力定量检测方法。根据Hp毒力基因vacA和cagA的序列设计特异性引物和探针,采用质控菌评估检测特异性;以梯度法设置引物浓度和退火温度,对反应体系及反应条件进行优化;以梯度稀释的DNA为模板,评估检测灵敏度;采用不同浓度模板开展重复性检测,评估检测精密度。结果显示,所设计的引物和探针可特异性地检测vacA和cagA基因,不受大肠杆菌等细菌干扰。vacA和cagA基因的最佳反应温度分别为55.0℃和57.9℃,最佳引物工作浓度分别为650 nmol/L和550 nmol/L,线性分析的拟合度R^(2)分别为0.9991和0.9995,不同浓度样品的变异系数(CV)值均小于10%。本研究建立的Hp毒力基因vacA和cagA数字PCR检测体系具有特异、灵敏和重复性好等优点,可为Hp病理诊疗和科学研究提供精准、可靠的技术支持。

数字PCR在病原体检测上的应用

数字PCR技术是一种高灵敏度、高特异性和可定量检测的技术,在病原体检测领域中具有广泛的应用。本文简要介绍了数字PCR技术在病原体检测中的应用情况。数字PCR技术可以用于病毒、细菌和真菌等不同类型病原体的检测,可以快速检测出病原体的存在和数量,并提供更可靠和精准的诊断方法,有助于疾病的早期诊断和及时治疗。数字PCR技术的优势在于其灵敏度高、特异性强、线性范围宽、可定量等特点,因此在病原体检测中具有极高的应用潜力。虽然数字PCR技术目前还存在一些问题和挑战,但通过优化引物和探针的设计,完善PCR反应条件的控制,建立严格的数字PCR检测标准等方面的改良方法,未来数字PCR技术很可能成为病原体检测领域中的主流技术。因此,数字PCR技术在病原体检测中的应用前景十分广阔。

H7亚型禽流感病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列,设计合成H7亚型AIV的引物和探针,对反应条件进行优化,从而建立检测H7亚型AIV的ddPCR方法,并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示,最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示,该方法仅对H7亚型AIV进行特异性检测,对H5亚型AIV、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量PCR(qPCR)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示,变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示,该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的H7亚型AIV ddPCR检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可用于H7亚型AIV的早期诊断、流行病学调查、诊断方法评估、标准物质研制、免疫效果评估,为H7亚型AIV的科学防控和研究提供了有力的技术储备。