创新数据非依赖性采集用于复杂基质目标蛋白质的定量分析

数据非依赖性采集（ DIA）是随着定量蛋白质组学而建立的质谱扫描技术。 DIA能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息,不会造成低丰度离子信息的丢失,同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。本研究基于静电场轨道阱Q-qIT-OT三合一质谱,发展了经典DIA方法以及WiSIM-DIA和Full MS-DIA两种全新DIA方法,并对Hela细胞全蛋白中添加的10条低浓度肽段进行定量分析,考察方法的线性、重现性和灵敏度。结果表明,3种方法的定量限均低至amol （14～435 amol）,并展示出良好的线性和定性确证可靠性。其中,WiSIM-DIA基于超高分辨一级监测定量,与经典DIA优势互补；Full MS-DIA的选择窗口仅3 amu,能够直接进行搜库鉴定,实现了数据依赖性采集（ DDA）和DIA的统一,摆脱了DIA依赖于DDA建立谱图库的局限性。

基于数据非依赖性采集质谱技术对注射用曲妥珠单抗及其类似药结构的表征及相似性研究

目的基于数据非依赖性采集(DIA)质谱技术对注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)及其类似药进行结构表征和相似性研究。方法用液相色谱/质谱(LC/MS)对赫赛汀及其类似药的完整蛋白及轻链和重链的相对分子质量进行测定;应用DIA质谱技术进行肽图分析,确定赫赛汀及其类似药的氨基酸全序列。结果LC/MS可准确测定赫赛汀的相对分子质量,赫赛汀类似药与原研药相对分子质量的偏差在1Da以内。应用DIA质谱技术对检测到的106个肽段进行肽图分析,显示赫赛汀类似药的氨基酸序列覆盖率>99%。赫赛汀类似药与原研药的相对分子质量和糖型信息相符、氨基酸序列完全一致。结论DIA质谱技术可用于赫赛汀及其类似药的结构表征和相似性比较研究,为今后其他单克隆抗体结构表征平台的建立提供了依据。

激素非依赖性前列腺癌分子靶向治疗研究进展

新近数据显示,全球范围内前列腺癌已成为男性第二位最常见的肿瘤;2008年全球新诊断的前列腺癌患者占据了全球新诊断肿瘤患者的14%（903500例）,同年大约有258400例患者死于前列腺癌[1]。

长链非编码RNA LINC00467促进非小细胞肺癌细胞的增殖

目的研究长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)LINC00467在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及细胞系中的表达及其对NSCLC细胞系功能的影响。方法利用高通量基因表达[Gene Expression Omnibus(GEO)]数据库提取GSE19804和GSE18842数据集的生物信息学资料,分析LINC00467在NSCLC组织和正常肺组织中的表达差异;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测收集的25对NSCLC癌组织及其癌旁组织以及NSCLC细胞系(A549、NCI-H266、NCI-H1299)和人正常支气管上皮细胞系HBE中LINC00467的表达;然后将NSCLC细胞系A549分别转染LINC00467siRNA(si-LINC00467组)和对照序列(si-NC组),分别采用流式细胞技术、CCK8和细胞克隆形成实验检测两组细胞的增殖情况,qRT-PCR和Western blot实验检测两组细胞细胞周期相关分子G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)和细胞周期分子细胞周期素蛋白依赖性激酶6(CDK6)的表达。结果 GEO公共数据库分析显示,LINC00467在NSCLC组织中的表达高于正常肺组织(P<0.05),与癌旁组织和上皮正常细胞相比较,NSCLC癌组织和细胞系中LINC00467的表达水平升高(P<0.05);A549细胞中si-LINC00467组中LINC00467表达水平明显低于si-NC组(P<0.01),且细胞活力和细胞克隆数均低于si-NC组,差异均有统计学意义(P<0.05);相较于si-NC组,si-LINC00467组CyclinD1和CDK6的表达受到明显抑制(P<0.05)。结论NSCLC组织及细胞系中LINC00467呈高表达,沉默LINC00467表达可明显抑制NSCLC恶性增殖的表型,可为NSCLC的靶向治疗提供潜在策略。

基于非依赖性全扫描采集蛋白组学技术初步研究继发性多房棘球蚴病小鼠差异表达蛋白

目的通过高分辨质谱数据非依赖性全扫描采集(data independent acquisition,DIA)蛋白组学技术鉴定多房棘球蚴病小鼠不同肝脏组织的差异表达蛋白,寻找其中可能与多房棘球蚴病致病相关的关键蛋白。方法分离多房棘球蚴病青海田鼠体内原头节,用原头节感染雌性昆明小鼠(6~8周龄)进行造模。小鼠分为实验组与对照组,实验组注射约3000个原头节,对照组注射等量生理盐水。两组小鼠培养1年后取实验组和对照组小鼠肝脏组织进行病理学检查,另取实验组小鼠肝脏病灶组织(病灶组)、病旁组织(病旁组)及对照组小鼠正常肝脏组织(正常组)进行蛋白DIA定量分析并筛选差异表达蛋白,对差异蛋白进行生物信息学分析。结果在病灶组与正常组间检出1020种差异表达蛋白,其中671种上调蛋白、349种下调蛋白;在病旁组与正常组间检出495种差异表达蛋白,其中327种上调蛋白、168种下调蛋白。京都基因和基因组百科全书(KEGG通路)富集分析显示,这些差异表达蛋白参与过氧化物酶体、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)信号通路、脂肪酸降解等重要通路。通过文献检索,发现过氧化物酶体及PPAR信号通路与肝损伤相关,在这两条通路中共筛选出脂肪酸转运蛋白1(Fabp1)、肝衰竭与长链脂酰CoA合成酶(Acsl1)、酰基辅酶A氧化酶1(Acox1)、三羟酰辅酶A脱氢酶(Ehhadh)、乙酰辅酶A酰基转移酶1b(Acaa1b)等几种可能与多房棘球蚴病致病相关的差异表达蛋白,这些差异蛋白在实验组小鼠体内表达量均显著下调。结论多房棘球蚴病小鼠肝脏内有大量蛋白质差异表达,其中Fabp1、Acsl1、Acox1、Ehhadh及Acaa1b等蛋白可能与多房棘球蚴病发病相关。

定量蛋白质组学质谱采集技术进展

质谱是定量蛋白组学的主要工具。近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速辨识芪玉三龙汤化学成分

利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)的数据非依赖性采集(DIA)技术,结合靶向筛查方法,快速辨识芪玉三龙汤(Qi-Yu-San-Long decoction,QYSLD)化学成分。以Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)为色谱柱,流速为0.2 mL/min,柱温为35℃,进样量为2μL,以0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾电离(ESI)源,以全信息串联质谱(MSE)技术在正、负离子模式下分别采集QYSLD复杂组分的质谱数据。通过检索文献和在线数据库,建立QYSLD中各单味药材化学成分库。将采集到的样品原始质谱数据与QYSLD化学成分库导入天然产物后处理筛查(UNIFI)平台;在UNIFI平台中设置参数(保留时间偏差为±0.1 min,精确质量数偏差阈值为±5×10^(-6),正离子模式下,选择[M+H]^(+)和[M+Na]^(+)为准分子离子或加合离子,负离子模式下,选择[M-H]^(-)和[M+HCOO]^(-))。经UNIFI平台对MSE模式下采集的质谱数据与自建数据库中成分作靶向筛查,结合化合物准分子离子、质谱裂解途径及部分对照品进行结构确认。从QYSLD中共识别出166种化学成分,其中皂苷类22种,生物碱类13种,黄酮类27种,萜类32种,氨基酸类20种,苯丙素类16种,有机酸类9种,甾醇类6种,蒽醌类6种,其他类15种。其中16种成分使用对照品作验证。研究建立的方法能够快速、可靠的表征QYSLD中的化学成分,为该复方的药效物质及质量控制研究奠定了基础。

一种基于深度学习的蛋白质组分析方法

目的基于液相色谱-串联质谱的数据非依赖性采集(data-independent acquisition,DIA)方法是蛋白质组数据获取的一种主要方式,采集的混合二级质谱由多个肽段同时碎裂组成,增加了肽段定性和定量的复杂度。目前主流的基于提取离子色谱图的方法需要经过预处理,构建色谱峰,提取色谱峰特征等操作。这类方法流程复杂,存在很多误差,并且不同的色谱图复杂度和色谱时间会影响定性和定量的准确度。针对该方法的不足之处,课题组提出一种基于深度学习的方法,直接对肽段进行定性和定量。方法与基于提取离子色谱图的方法不同,本课题组没有使用色谱维度的信息,不会受到色谱图复杂度和色谱时间等因素的影响。将预处理后的质谱数据输入到两个基于卷积神经网络(convolutional neural network,CNN)的模型中,通过二分类和回归预测的方式,解决定性和定量问题。结果课题组在公开数据集上进行了实验,与准确度较高的FIGS相比,提高了定性结果的重复性,在保证定量准确度的同时提高了不同丰度下的肽段定量数量。结论本文提出的基于深度学习的模型,没有使用色谱维度的信息,可以有效地对肽段进行定性和定量。

基于DIA蛋白质组学技术联合PRM验证探讨去卵巢骨质疏松大鼠差异蛋白表达

目的:基于非数据依赖性采集(DIA)蛋白质组学联合平行反应监测(PRM)靶向质谱技术筛选去卵巢大鼠股骨组织的差异蛋白,寻找其中可能与骨质疏松(OP)发病相关的关键靶蛋白。方法:Wistar雌性大鼠16只,随机分为正常对照组和模型对照组各8只,模型对照组采用卵巢切除法建立骨质疏松症模型。12 w后双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度(BDM);解剖分离股骨标本进行Micro-CT扫描和重建;对正常对照组和模型对照组大鼠股骨组织进行蛋白DIA定量分析,筛选差异蛋白并进行生物信息学分析,并采用PRM技术验证两组间差异蛋白。结果:造模12 w后,与正常对照组比较,模型对照组骨小梁数量(Tb.N)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、连接密度(Conn.D)均明显下降(P<0.05或P<0.01),骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)显著升高(P<0.01);Micro-CT三维重建可见骨小梁整体结构退变、体积减少、连接断裂;DIA检测鉴定出显著差异蛋白234个,其中上调蛋白162个,下调蛋白72个,KEGG通路富集显示这些差异蛋白主要参与粘着斑、RNA转运、TGF-β、等信号通路。对关键差异蛋白进行PRM建库分析,检测到27个候选蛋白,其中双特异性丝裂原活化蛋白激酶1(MAP2K1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、等11个蛋白定量分析明显具有差异(P<0.05或P<0.01)。结论:OP大鼠股骨组织内有大量蛋白质差异表达,MAP2K1、GPX4、MAPK1、COMP等11个差异蛋白可能与骨质疏松发病密切相关。

基于蛋白质组学探讨抗纤益心方治疗扩张型心肌病的作用机制

目的:筛选抗纤益心方干预扩张型心肌病(DCM)大鼠的差异表达蛋白质,分析探讨抗纤益心方治疗DCM的分子作用机制。方法:雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照(control)组、模型(model)组、抗纤益心方(KXYX)组,其中control组正常饮水饮食,不施加任何干预,model组以同体积0.9%氯化钠溶液灌胃,KXYX组以抗纤益心方灌胃,连续灌胃干预4周。通过数据非依赖性的扫描模式(DIA)蛋白组学鉴定各组间差异蛋白。结果:KXYX组与model组比较,共发现52个差异蛋白,35个上调蛋白,17个下调蛋白;差异蛋白主要分布于线粒体及细胞质内;生物过程主要包括硫化物代谢过程、细胞酰胺代谢过程、内质网介导高尔基体囊泡转运、细胞氨基酸代谢过程、小分子生物合成等;主要分子功能包括催化活性、细胞骨架蛋白结合、辅酶结合、胶原蛋白结合、NAD结合、肌动蛋白结合、氧化还原酶活性等;主要富集通路包括内质网蛋白质加工、心肌收缩、氨基酸的生物合成、产热通路等。结论:KXYX组与model组的蛋白质表达存在明显差异,抗纤益心方治疗DCM的作用机制可能与修复调节差异蛋白及信号通路相关。

DI-MS/MSALL法快速定性分析金银花的化学成分

该文建立直接注射-多级质谱全扫描(DI-MS/MSALL)方法,综合直接注射的快速分析优势、高分辨质谱强大的质谱分离(mass spectrometric separation)功能以及气态离子分段(gas phase ion fractionation)技术,全面采集每个单位质量窗二级质谱图,并利用DI-MS/MSALL定性分析中药金银花的提取物化学成分组成。通过二级质谱母离子归属,质谱裂解规律推导,以及与文献数据对照,从金银花提取物中初步鉴定了54个化合物,包括21个酚酸类化合物、13个黄酮类化合物、12个环烯醚萜类化合物、4个三萜类化合物以及4个其他类化合物。因此,DI-MS/MSALL是中药等复杂体系化学成分的全面、快速、准确定性分析的有力工具。

利用定量蛋白组学对脓毒症外周血单个核细胞差异蛋白的研究

目的 探讨基于数据非依赖性采集高分辨率色谱- 质谱技术（data independent acquisition liquid chromatography-mass spectrometry, DIA LC-MS）对于脓毒症外周血差异蛋白研究的可行性。方法 采用前瞻性研究，纳入2016 年4 月至2016 年7 月复旦大学附属上海市第五人民医院重症监护室（ICU）收治的10 例脓毒症以及10 例同时期入住ICU 年龄性别相仿的术后未并发脓毒症的患者（疾病对照组）。采用最新的数据非依赖性采集技术（data independent acquisition，DIA）联合skyline 数据提取软件对10 例脓毒症和10 例对照组的外周血单个核细胞的蛋白进行研究分析，所得的数据分别采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法- 判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）进行模式识别分析，确定外周血单个核细胞的差异蛋白，进行通路分析以及GO 分析。根据PLS-DA 模型变量的重要性投影（variable importance in the projection, VIP 值）初步筛选可能的蛋白标志物，并对贡献最大（VIP 〉1, P〈0.05）的3 个蛋白进行ELISA 验证和ROC 曲线的分析。结果 总共鉴定到了1 062 个碎片离子加和得到119 个差异蛋白，其中31 个蛋白上调，88 个蛋白下调。通过通路分析发现与碳代谢，血小板激活，细菌侵袭上皮，补体凝血瀑布激活有关。其中高迁移率蛋白1（HMGB-1），中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），基质金属蛋白酶8（MMP-8）用ELISA 验证在脓毒症与疾病对照组的外周血单个核细胞表达中差异有统计学意义（P〈0.01）。ROC 曲线下面积均大于0.85，有较好的敏感度和特异度。结论 利用DIA-MS 技术对脓毒症外周血单个核细胞进行研究检测，PLS-DA、OPLS-DA、PCA 模式识别均能用于蛋白组学数据的分析，初步筛选HMGB-1、NGAL、MMP-8 是值得进一步研究的脓毒症外周血单个核细胞候选生物标志物。

下咽鳞癌蛋白质谱鉴定及预后靶分子筛选

目的利用非数据依赖性采集(DIA)蛋白质组学技术筛选下咽鳞癌晚期肿瘤预后相关的特异性靶分子。方法选取2016年1月至2018年9月在上海市第一人民医院确诊的5对晚期下咽鳞癌的癌组织和癌旁组织,对蛋白组织进行裂解研磨、蛋白电泳、组织酶解、肽段标记、分级标记、高效液相色谱系统分离,采用Q-Exactive质谱仪完成质谱分析。定量分析及生物信息学分析、筛选预后相关蛋白分子。结果建立下咽鳞癌蛋白组学数据库:蛋白质7 395个,肽段63 190个,筛选出的差异蛋白上调36个、下调43个,差异表达蛋白质总数79个。完成层次聚类分析基因本体论和京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析、蛋白互做分析,筛选出关键蛋白MRPS5,为下咽鳞癌预后的特异性靶分子。结论 MRPS5可能为下咽鳞状细胞癌的预后靶分子。