利用激光扫描共聚焦显微术对同源四倍体水稻胚囊形成与发育的进一步观察

应用改进的整体染色透明激光扫描共聚焦显微术(WCLSM),对同源四倍体水稻PDER-2B-4x胚囊的形成与发育过程进行观察。发现其胚囊的形成发育过程与二倍体的一致,可以清楚地划分为8个发育时期,即孢原细胞形成期、大孢子母细胞形成期、大孢子母细胞减数分裂期、功能大孢子形成期、单核胚囊形成期、胚囊有丝分裂期、八核胚囊发育期和成熟胚囊期。除正常发育的过程外,大孢子发育的各个过程均出现一些异常现象,包括:细胞退化、核位置异常、核数目异常和细胞分化异常等。这些异常可能最终导致多种结构异常成熟胚囊的形成。

双光子及共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对人绒癌细胞的作用机制

天花粉蛋白 (trichosanthin ,TCS)是从中草药栝楼根中提取的一种核糖体失活蛋白 ,具有抗肿瘤和抗HIV功能 .应用双光子及共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针Hoechst 3334 2、 2′,7′ 二氯荧光黄双乙酸酯(DCFH DA)、Indo 1和Fluo 3 AM ,首次同时观察了TCS诱导人绒癌细胞 (JAR细胞 )凋亡过程中活性氧自由基 (ROS)和细胞内钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)的变化 ,实验结果表明TCS引起的 [Ca2 + ]i 升高和ROS形成参与了TCS诱导的JAR细胞凋亡 ,并且ROS形成和 [Ca2 + ]i 升高有关 .共聚焦激光扫描显微术的研究结果表明 ,[Ca2 + ]i 升高不是导致ROS形成的主要原因 。

应用激光扫描共聚焦显微成像术研究光敏剂亚细胞定位

目的应用激光扫描共聚焦显微成像系统及荧光定量分析方法,探讨血卟啉单甲醚(HMME)在靶细胞亚细胞结构中的精确定位及定量分析的可行性。方法将传代培养的鼠肺内皮细胞与HMME共同孵育24h。应用激光扫描共聚焦显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针若丹明(rhodamine)-123、荧光素黄(luciferyellow)、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体。采取不同的采集顺序激发染色细胞样品,通过预先设置的相应的发射滤光片分别采集细胞内HMME与细胞器探针的荧光图像。通过计算机图像处理,采用像素-荧光强度分析方法对光敏剂进行亚细胞定位。结果采用先激发探针后激发HMME的顺序,HMME及荧光探针的荧光强度及形态特征保持较好;细胞质与细胞核内HMME平均荧光光强差异有显著意义,前者是后者的2倍以上;HMME在4种细胞器区域平均荧光光强与细胞平均荧光光强(J1/J2)比值的差异有显著意义;随参数m的增高,HMME在4种细胞器区域J1/J2比值呈下降趋势。结论HMME在细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体均有分布;应用激光共聚焦显微成像系统结合荧光定量分析法能对荧光效率极低的光敏剂进行精确的亚细胞定位及分布定量比较。

共聚焦激光扫描显微术研究天花粉蛋白对小鼠胚胎细胞的作用机制

天花粉蛋白是从中草药禾古楼根中提取的一种核糖体失活蛋白 ,具有致流产、抗肿瘤和抗 HIV功能。本文应用共聚焦激光扫描显微术结合特异性荧光探针 2′,7′-二氯荧光黄双乙酸酯和 Fluo3- AM,观察了天花粉蛋白作用于小鼠胚胎细胞过程中活性氧自由基和细胞内钙离子浓度的变化。实验结果表明 ,天花粉蛋白能诱导小鼠胚胎细胞钙浓度升高和产生活性氧自由基 ,并且天花粉蛋白能有效抑制小鼠胚胎细胞的分裂 。

应用激光扫描共聚焦显微术观察血小板活化及其形态改变

目的建立应用激光扫描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy,LSCM)观察血小板活化及其形态改变的方法。方法用不同浓度的胶原诱导血小板活化,通过LSCM观察与特异性荧光(FITC/PE)抗体结合的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)荧光强度的变化,判断血小板微颗粒(platelet microparticle,PMP)的产生,同时观察正常人和糖尿病视网膜病变患者血小板形态的差异。结果加入诱导剂后血小板活化,镜下观察特异性抗体标记的血小板荧光强度呈规律性变化。在一定浓度时诱导剂胶原的加入可引起血小板GPⅡb/Ⅲa表达量的变化,且随着胶原浓度的增加,GPⅡb/Ⅲa表达量也有增加的趋势。并观察到糖尿病视网膜病变患者血小板有伪足伸出,末端附近有释放的微颗粒环绕,与正常人血小板形态有明显差异。结论应用LSCM可观察到诱导剂致血小板活化引起GPⅡb/Ⅲa表达量的变化以及血小板微颗粒的释放,同时可认为血小板形态改变的观察在血栓病血小板活化程度的判断上具有一定的价值。

激光扫描共聚焦显微术在生物医学中的研究

激光扫描共聚焦显微技术的发展 ,为形态学、分子细胞生物学、神经科学、肿瘤医学、药理学、遗传学等领域的研究提供了新的先进研究方法和手段。本文对激光扫描共聚焦显微术在粘附细胞分选 ,动态荧光分析测定 ,显微细胞外科和光陷阱技术 。

利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育形态学变化

通过激光扫描共聚焦显微镜,利用不同种类(波长)的激光研究植物细胞发育形态学变化。结果表明,利用紫外激光(351 nm)扫描可以清楚地观察到拟南芥叶片表皮细胞的形态及其变化,在已分化的叶片表皮上可观察到包括“铺垫”表皮细胞(epidermal pavement cells)、气孔保卫细胞(guard cell)、气孔伴胞(subsidiarycells)、表皮毛细胞(trichomes)和表皮毛的足细胞(socket cells)等多种形态不同的细胞种类;利用蓝光激光(488nm)辅助曙红浅染,可清晰地显示出拟南芥根生长区内部的各种原始细胞,包括静止区(quiescent center)细胞、皮层/内皮层原始细胞(cortex/endodermal initial cell)、表皮/根冠原始细胞(epidermal/root cap initial cell)和中柱/根冠原始细胞(columella/root cap initial cell)等。利用双光子激光(800 nm)连续扫描30 s可以诱发叶绿体产生自发荧光,并可观察到叶绿体在叶肉细胞中的运动轨迹。结果说明激光扫描共聚焦显微镜在植物细胞形态及发育研究上具有独特的功能。

激光扫描共聚焦显微镜显示土壤原生动物细胞结构的研究

介绍了一种运用激光扫描共聚焦显微术显示土壤原生动物细胞结构的方法,试验结果较清晰地显示出该纤毛虫细胞表面纤毛器及纤毛器基部附属微管结构,并总结了试验操作过程中的注意点。

激光共聚焦显微术在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用

激光扫描共聚焦显微术因其具有成像分辨率高,可实现对活性细胞动态定量测量及三维重建等优势,用于中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡的研究中,包括以下几个方面:肿瘤细胞细胞核变化观察;细胞内钙离子浓度测定;线粒体膜电位测量;凋亡相关基因表达等。

共聚焦激光扫描显微镜在Mohs显微切除术中的应用

目的:明确共聚焦激光扫描显微镜(GLSM)在Mohs显微切除术中的应用价值。方法:对46例皮肤肿瘤患者行Mohs显微切除术,对57例标本(36例患者行1次手术切除,9例2次,1例3次)的侧面和底面行CLSM扫描及快速冰冻病理切片检查。结果:病理检查示:46例标本未检测到肿瘤组织,11例标本检测到肿瘤细胞组织,CLSM示:45例标本未检测到肿瘤组织,12例标本检测到肿瘤组织。CLSM扫描与快速冰冻病理切片之间在检测有无肿瘤组织方面无明显差异(P>0.05)。结论:在Mohs显微切除术中CLSM可以代替快速冰冻病理检测肿瘤组织残留。

激光扫描共聚焦显微镜观察冻存对SHR卵母细胞的影响

目的 冻存未受精的成熟卵母细胞（MII期）比冻存同一品系的处于卵裂期的胚胎更困难。因为卵母细胞的某些内部结构对低温很敏感。本研究的目的是希望能够更有效地观察冻存对卵母细胞的影响。方法 我们运用激光扫描共聚焦显微术（CLSM）的光学切片和三维图像重建技术，研究冻存对自发性高血压大鼠（SHR）卵母细胞的结构，尤其是对纺锤体、染色体的影响，以及冻存对体外受精的影响。结果 我们不仅观察到有的卵母细胞冻存后仍维持着完整的桶状纺锤体以及紧密排列的染色体，而且能观察到卵母细胞内均匀分布着细胞质微管星体。冻存也造成对一些卵母细胞纺锤体和细胞质微管星体的破坏。结论 CLSM能够清晰有效地观察冻存对未受精卵纺锤体、染色体以及胞质微管星体的影响，我们推想冻存后卵母细胞的体外受精率下降与这些结构的受损有关。

体外细胞培养中甲肝病毒的连续传代及激光扫描共聚焦成像

观察甲肝病毒(HAV)在体外细胞培养中连续传代的特点及细胞内病毒荧光的激光扫描共聚焦成像。实验中采用了间接免疫荧光法(IF)与激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)结合技术,并与ELISA进行比较。LSCM技术发现将NJ-3株HAV接种于PLC/PRF/5细胞1 h后细胞表面有病毒吸附,2-4 h病毒吸附量增多,4 h后逐步减少。在病毒随细胞连续传代中,至第7代病毒增殖量可达到稳定状态并至少可连续传77代,感染病毒的细胞可达95％以上;细胞传代或病毒收获的最佳周期为5 d;经多次冻存、复苏,仍保持良好的细胞形态和产毒性能。结果表明LSCM技术能更早地检出细胞表面吸附的少量病毒和胞浆内微弱的HAAg荧光,而ELISA则需要较多量病毒才能显示阳性。提示前者更适合于少量病毒时的定性,特别是在初次病毒分离时;后者则适合于病毒量较多时的整体定量。

阔口尖毛虫纤毛器微管的激光共聚焦显微镜观察

应用激光扫描共聚焦显微术显示经荧光紫杉醇标记的阔口尖毛虫(Oxytricha platystoma)口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛等纤毛器的微管类细胞骨架。其口围带基部含小膜托架、托架间连接微管和小膜基部微管束,波动膜基部含发达的微管骨架网,口围带和波动膜后端的汇合处含有口底托架及口后微管束,额腹横棘毛和左、右缘棘毛基部含前纵微管束、后纵微管束、横微管束或周围微管束。结果表明,阔口尖毛虫的纤毛器基部微管具有其种的特异性,尤其是波动膜在其特长的纤毛列基部形成发达的微管骨架网,这种巨大型波动膜及其基部微管骨架在尖毛科乃至其他腹毛类纤毛虫中未见报道;且本文所见的纤毛虫口底托架及口后微管束可能是腹毛类纤毛虫中普遍存在的口纤毛器基部微管结构。

剪切力对耳蜗微血管内皮细胞细胞骨架的影响

目的观察不同剪切力对体外培养的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞形态学及细胞骨架的影响。方法用自制的流体力学装置在不同时相点、以不同剪切力对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞行力学作用,获得形态学图象,同时对其细胞骨架在激光扫描共聚焦显微镜下行F-actin荧光染色测定分析。结果不同大小的剪切力作用会导致细胞形态发生变化;细胞形态变化后会出现应力纤维改变,应力纤维的变化早于形态学改变,这种改变随剪切的时间、力量变化而变化。结论豚鼠耳蜗微血管内皮细胞在受到剪切力作用后之所以会产生形态学改变,可能与细胞骨架变化有关。

广东高州普通野生稻与粳稻杂交F1胚囊育性及发育特点

利用整体染色激光扫描共聚焦显微术(WE-CLSM),对广东高州普通野生稻与粳稻台中65杂交F1的成熟胚囊育性、胚囊形成发育及受精特点进行研究。杂种F1成熟胚囊平均育性为64.61%。不同杂种的成熟胚囊均存在不同程度的异常现象,异常的主要类型有:胚囊退化、小胚囊、雌性生殖单位退化、卵器退化、极核数目或位置异常及其他异常等类型。其中频率最高的异常类型为雌性生殖单位退化(10.49%),其次是胚囊退化(9.80%)。杂种F1的胚囊发育过程与高州野生稻原种基本一致,育性低的杂种F1胚囊发育过程出现多种异常现象。对3个杂种F1受粉后1 d的胚囊进行观察发现,除正常受精膨大的胚囊外,还存在结构正常未受精和结构异常未受精等异常现象。受粉后7 d的胚囊基本上与受粉后1 d的相似。研究结果表明,广东高州普通野生稻可能具有决定杂种F1胚囊育性的不同基因,包括中性基因等。

同源四倍体水稻胚乳发育:极核融合和胚乳细胞化

利用激光扫描共聚焦显微术和塑料包埋半薄切片技术观察同源四倍体水稻极核融合及游离核进一步发育的过程 ,发现同源四倍体水稻约有 1 /3子房极核融合过程和游离核进一步发育与其二倍体原种的基本一致 ;2 /3子房出现各种异常现象 ,如极核未受精、受精异常和胚乳游离核发育滞后等。应用荧光增白剂染色对胚乳细胞化过程进行观察 ,直接观察到胚乳初生壁的出现和形成过程以及不同部位的胚乳细胞壁的形成机理。表明同源四倍体水稻与二倍体水稻胚乳的细胞化过程基本一致 ,胚乳细胞初始垂周壁来源于珠孔端胚囊壁内突向心游离生长 ,初始平周壁来源于游离核有丝分裂产生的成膜体 ,而中间胚乳细胞壁则有些来源于游离核有丝分裂产生的成膜体 ,有些是自由生长而来。同源四倍体水稻胚乳细胞化过程也出现相当比例的异常现象 ,如无细胞壁形成、细胞化不同步和产生分枝状的细胞壁等。同源四倍体水稻胚乳发育过程中出现的极核融合。

同源四倍体水稻亚种间杂种胚囊的结构及受精特点

利用激光扫描共聚焦显微术对11份同源四倍体水稻亚种间杂种的胚囊结构和双受精特点进行研究，结果表明，所有四倍体杂种均存在一定频率的败育胚囊，败育频率因组合而异，最高的败育率为23．8％，最低为5．5％，平均14．3％。败育胚囊主要有胚囊退化、异常小胚囊、无卵器、无雌性生殖单位和极核位置异常等5种类型。杂种在双受精过程中也存在一定频率的异常，包括胚囊结构正常但未能受精和受精停滞等，其中未能受精的频率为3．5％～11．9％。平均7．9％，受精停滞的频率为1．1％～6．2％，平均3．7％。另外，还存在低频率（平均4．7％）的胚乳发育受阻。认为部分胚囊败育和受精异常（包括未能受精和受精停滞）是导致同源四倍体水稻亚种间杂种结实率降低的主要原因。

广东高州普通野生稻生殖特性的研究 Ⅱ.胚囊育性、胚囊发育、胚胎发生和胚乳发育

利用整体染色激光扫描共聚焦显微镜术(WCLSM),对采自广东省高州市6个地点共141个编号的高州普通野生稻的成熟胚囊育性和胚囊形成发育特点等进行研究。结果表明,供试的绝大多数高州普通野生稻材料成熟胚囊均存在不同程度的育性异常现象,包括雌性生殖单位退化、极核位置异常、极核数目异常、胚囊退化等。这些异常结构的胚囊由于没有正常的卵细胞,不能正常受精,影响子粒结实。141个编号平均异常胚囊频率为11.11%,最高异常率为67.86%。高州普通野生稻胚囊发育过程与正常栽培稻一致,属蓼型。对一些结实率偏低材料的研究,发现在胚囊发育过程的不同时期存在一些异常现象,包括功能大孢子退化,二至八核胚囊发育异常等。对柱头上的花粉量调查,发现观察的69个编号中,多数编号柱头上花粉量偏少。研究表明,花粉量偏少影响受精是导致结实率偏低的最主要原因之一。本文对导致结实率偏低的综合因素进行了讨论。