D3胚胎卵裂球数目与胚胎发育潜能和整倍性的相关性研究

目的通过高通量测序技术(NGS)探讨D3胚胎卵裂球数目与胚胎发育潜能和整倍性之间的关系。方法回顾性分析2018年1月至2021年12月于本院生殖中心行胚胎植入前非整倍体遗传学检测(PGT-A)助孕的261个治疗周期共920枚活检囊胚的数据资料,根据D3胚胎卵裂球数目不同进行分组(4细胞组、5细胞组、6细胞组、7细胞组、8细胞组、9细胞组、10细胞组及≥11细胞组),评估各组后续获得优质囊胚和整倍体囊胚的机会,并统计分析各组间临床结局的差异。结果(1)与8细胞组相比,5细胞、6细胞、7细胞及10细胞组优质囊胚率显著降低(P=0.00),调整女方年龄因素以后,差异仍有显著性(P=0.00);卵裂球数目合并分组后,≤7细胞组、9~10细胞组的优质囊胚率显著低于8细胞组,调整年龄因素以后,差异仍有显著性(P<0.05);≥11细胞组优质囊胚率与8细胞组间无显著性差异(P=0.51),调整女方年龄后,仍无显著性差异(P=0.45)。(2)与8细胞组相比,其他各组囊胚的整倍体率均无显著性差异(P>0.05);调整年龄后,各组间囊胚整倍体率仍无显著性差异(P>0.05);卵裂球数目合并分组后,各组间随着卵裂球发育速度增快,囊胚整倍体率增加,但差异尚无统计学意义(P>0.05);调整年龄混杂因素后,各组间的囊胚整倍体率仍无显著性差异(P>0.05)。(3)随着卵裂球数目增加,各组临床妊娠率、活产率呈上升趋势;卵裂球数目合并分组后,≥11细胞组的临床妊娠率和活产率最高,≤7细胞组的临床妊娠率和活产率最低,但差异均尚无统计学意义(P>0.05)。结论D3卵裂期胚胎的发育潜能随着卵裂球数目的增加而增加,≥11细胞的D3快速分裂胚胎具有同8细胞胚胎相似的整倍体率和活产率,为临床单胚胎移植胚胎选择策略提供一定的参考。

卵母细胞非整倍性改变的研究进展

妊娠失败和胎儿流产的主要原因之一是卵母细胞的非整倍性改变,并且发生率随着母亲年龄的增大而增加,三体和单体(非整倍体)胚胎至少占人类妊娠的10%,对于接近生殖寿命终点的女性,发生率可能超过50%。导致非整倍体的错误几乎总是发生在卵母细胞中,但尽管进行了深入研究,潜在的分子基础仍然令人难以捉摸。现回顾最近的研究,探讨女性减数分裂中导致非整倍体的可能机制。

优化样品留取方法可提高囊胚培养液中游离DNA整倍性的检测效率

目的探讨利用囊胚培养液中游离DNA检测胚胎整倍性的样品留取优化方案。方法本研究共纳入239枚囊胚,所有的囊胚均来源于北京大学第三医院生殖中心胚胎植入前遗传学整倍体检测技术(PGT-A)周期。纳入患者的PGT-A指征为女方高龄(>38岁)、复发性流产、反复着床失败。胚胎在D3天更换囊胚培养液,并采取单胚胎单独培养,收集可以PGT-A活检囊胚的培养液。收集方法根据是否胚胎打孔以及胚胎培养时长分为三个阶段。PGT-A囊胚活检的滋养层细胞采用SNP芯片检测整倍性;培养液游离DNA采用二代测序方法(NGS)进行无创胚胎染色体整倍性筛查(NiPGT-A);背靠背比较两者的结果,分析NiPGT-A方法的检出率、NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率、非整倍体符合率、颗粒细胞污染率等。共有56枚PGT-A整倍性胚胎移植,分析对应胚胎的NiPGT-A结果,统计临床妊娠结局。结果239枚囊胚中209枚囊胚有NiPGT-A结果,检出率为87.5%。随着采样方法的改进,NiPGT-A结果与PGT-A结果倍性一致性、整倍体符合率逐渐提高;颗粒细胞污染率逐渐降低。239枚胚胎中有56枚PGT-A整倍体的胚胎移植,23枚胚胎的结局为活产/持续妊娠。NiPGT-A没有结果的胚胎妊娠率较高(71.4%),高于NiPGT-A为整倍体或者非整倍体胚胎的临床妊娠结局(33.3%,40.9%)。结论囊胚培养液的样品留取方法对于NiPGT-A检测至关重要,推荐D3天再次去除颗粒细胞、采集D4-D5/6天囊胚培养液,而且不要针对胚胎进行打孔处理。

引物原位标记技术快速诊断精子染色体非整倍性

目的:探索应用引物原位标记技术分析精子染色体非整倍性的可靠性。方法:采用3mol/LNaOH溶液对精子标本进行快速而有效的预处理,此步骤能够对精子细胞核同时进行去浓缩和变性,分析正常男性的8份精液标本的17条染色体和性染色体的非整倍性。结果:二体频率为0.28%至0.36%,染色体间在二体频率上无显著差异,但是21号染色体的不分离频率比其它染色体要高。结论:引物原位标记技术是一种简便、快速、经济的精子染色体非整倍性分析方法,具有较强的敏感性和特异性。

精卵细胞非整倍性研究进展

非整倍性是人类染色体异常中最常见的一种类型。本文通过对精卵细胞非整倍性研究的进展进行综述，阐述非整倍性与父母年龄、减数分裂不分离和染色体基因重组的关系，并简介非整倍性机理的几种假说。

引物介导的原位DNA合成技术及其在精子染色体非整倍性研究中的应用

对引物介导的原位DNA合成技术及其在精子染色体非整倍性研究中的应用作一综述.PRINS技术是一种新的分子细胞遗传学方法,因该法能提供快速(1～4h)、准确及高效的结果,正作为荧光原位杂交的替代或补充方法在人类染色体研究中加以应用.

单细胞多重替代扩增法结合比较基因组杂交技术检测植入前发育停滞胚胎染色体非整倍性

目的：应用单细胞多重替代扩增法（MDA）结合比较基因组杂交（CGH）技术检测植入前发育停滞胚胎染色体非整倍性情况,探讨植入前胚胎发育停滞机制。方法：胚胎植入前对70枚6~8细胞期发育停滞胚胎中取单个卵裂球与正常男性外周血单个淋巴细胞,分别采用多重替代扩增法（MDA）进行全基因组扩增,将发育停滞卵裂球扩增产物标记绿色荧光,淋巴细胞扩增产物标记红色荧光,应用CGH技术进行分析,观察染色体的非整倍性变化情况。结果：对70枚植入前发育停滞的胚胎有7枚出现染色体非整倍性改变,2枚卵裂球染色体为46,XY,dup（Y）（q12）;其余5枚卵裂球的染色体分别为45,X;47,XY＋21;47,XY＋1;46,XY,dup（17）（q23）;46,XX,dup（20））（p12）;染色体异常的发生率为10%。结论：染色体非整倍性改变可能是植入前胚胎的发育停滞的原因之一。

Time-lapse是否能预测胚胎染色体整倍性？

Time-lapse技术推进了胚胎评估的方法学,为胚胎评估带来了新的视角。Time-lapse系统理论上应具有预测胚胎染色体整倍性的潜力,但还需临床研究证实。

引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性

染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型,经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。文章应用引物原位标记(Primed in situ labeling,PRINS)技术快速检测人类染色体非整倍性,率先采用更新的非ddNTP阻断的多色PRINS技术,对人类外周血淋巴细胞和精子等多种样本进行标记;然后对不同靶标序列的标记效率及不同荧光色素的发光特点通过实验进行评估,获得关于PRINS技术的多项反应原理参数,并筛选标记顺序以获得均一稳定的标记效果,最后进行临床FISH探针与PRINS的标记比较实验。通过实验比较PRINS技术与传统FISH技术之间的标记特点与差别,评估PRINS的实际应用效果。在2.5h内标记了同一精子核内的多条染色体,单色以上标记达到99%。同时在人类外周血淋巴细胞中也得到较好的标记效果。与FISH技术相比,PRINS的这些优点使得它成为诊断染色体非整倍性变异的首选技术。

石龙芮染色体非整倍性和染色体异常的观察

通过对江西 4产地石龙芮的体细胞染色体观察和初步统计 ,发现 2n =3 2的体细胞占观察细胞总数的5 6.1 % ,同时普遍存在非整倍性体细胞现象 ,其中 2n为 2 6、2 8、3 0的分别占 9.3 %、9.3 %和 1 3 .0 % ,2n为 1 6、2 4的分别占 3 .4%和 8.8%。另外 ,还观察到少数染色体异常出现的染色体桥 ,并就以上内容和静止期的核型初步探讨了石龙芮种内演化问题。

紫鸭跖草体细胞与生殖细胞的非整倍性及其诱发研究

在人类群体中非整倍性是个严重的遗传问题。这种在数目上的染色体畸变的主要原因是染色体不分离。本实验拟建立一种研究染色体不分离机制与鉴定引起染色体不分离的诱变剂的体系。研究结果表明，紫鸭跖草（Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａｒｅｆｌｅｘａ）植物具有较高的染色体不分离自发频率，是一种研究诱发非整倍性的较好体系。

PGT周期中0PN和1PN来源胚胎的整倍性结果分析

目的:通过array-SNP技术分析1PN和0PN(2pb)来源的囊胚染色体的整倍性,探讨其移植价值。方法:回顾分析2013年至2018年于北京大学第三医院生殖医学中心行ICSI-PGT助孕,且1pn和0pn(2pb)来源的胚胎有囊胚形成的患者,共92个PGT取卵周期,。结合PGT检测,比较1pn和0pn(2pb)胚胎来源与2PN胚胎来源活检囊胚的染色体整倍性及临床妊娠率等。结果:2PN来源、1PN来源、0PN来源的活检囊胚的染色体整倍体率分别为46.53%(161/346)、63.33%(19/30)、28.21%(22/78)。1PN来源和2PN来源的活检囊的胚染色体整倍体率均高于0PN来源的活检囊胚,差异有统计学意义(P<0.05);1PN来源的活检囊胚的染色体整倍体率高于2PN来源的活检囊胚,但差异无统计学意义(P>0.05)。0PN与1PN来源囊胚移植的临床妊娠率比较,差异无统计学意义。结论:对于PGT周期患者,行ICSI后的0PN(2pb)以及1PN来源的胚胎培养后形成囊胚,通过芯片技术检测其染色体正常的囊胚仍占一定比例,可作为可移植囊胚进行移植。

荧光原位杂交检测7号染色体非整倍性与肌层浸润性膀胱癌的相关性

背景与目的术前预测肌层浸润情况对于充分治疗膀胱癌(bladder cancer,BC)非常重要。目前,术前准确诊断BC肌层浸润状态仍存在一些难点。本研究旨在探讨BC荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测结果与肌层浸润情况的相关性,绘制用于术前区分肌层浸润性BC(muscleinvasive BC,MIBC)和非肌层浸润性BC(non-muscle-invasive BC,NMIBC)的细胞遗传学–临床列线图。方法所有符合入选标准的BC患者均接受术前FISH检测,包括4个位点[染色体着丝粒特异性探针(chromosome-specific centromeric probe,CSP)3、7和17以及基因座特异性探针(gene locus-specific probe,GLP)-p16位点]。使用Chi-square检验分析FISH与BC肌层浸润的相关性。在训练集中,采用单因素和多因素logistic回归分析建立术前预测肌层浸润的细胞遗传学–临床列线图。在训练集中评估列线图预测肌层侵润的效果,包括辨别准确度、校准度和临床实用性,并在验证集中进行验证。此外,通过模型比较评估列线图与用于构建该模型的各个变量的鉴别力和临床实用性。结果在CSP3、CSP7和CSP17阳性的BC患者中,肌层浸润更为普遍(OR=2.724,95%CI:1.555–4.774,P<0.001;OR=3.406,95%CI:1.912–6.068,P<0.001;OR=2.483,95%CI:1.436–4.292,P=0.001)。通过训练集多因素logistic分析,影像学测定肿瘤大小、临床肿瘤分期和CSP7状态被确定为BC肌层侵润的独立危险因素。然后,建立了包含这3个独立危险因素的细胞遗传学–临床列线图,并在训练集(AUC=0.784;95%CI:0.715–0.853)和验证集(AUC=0.743;95%CI:0.635–0.850)中得到令人满意的区分度。决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)表明列线图具有临床实用性。在模型比较中受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析表明,与任一用于构建该模型的单独因素相比,细胞遗传学–临床列线图显示出更高的鉴别力,并且在DCA中的整个的阈值概率范围内具有最高的净收益。结论CSP7情况是BC患者肌层侵润的独立预测因素,并成功纳入到结合了FISH分析结果与临床危险因素的临床列线图中。

体外受精中未受精卵细胞非整倍性的研究进展

卵母细胞的非整倍体改变是体外受精失败的重要原因。从纺锤体形成到染色单体分离出现的异常都有可能导致染色体的分离不均,从而导致非整倍体产生。卵细胞的线粒体结构与功能异常可导致卵细胞功能丧失,以至受精失败。第一极体的形成是卵细胞胞核成熟的标志,通过评估其形态可了解卵细胞的老化程度。近年采用荧光原位杂交(FISH)、光谱核型分析(SKY)、比较基因组杂交(CGH)、聚合酶链反应(PCR)等先进的分子生物学技术可分析全部染色体。分子遗传学方法比细胞遗传学快速,在收到标本24～48h即可得到结果,有快速、准确、效率高、特异性好、敏感度高等优点。

检测着床前胚胎非整倍性诱变的小鼠动物模型

目的 :建立检测化学物对着床前胚胎是否具有非整倍诱变性的动物模型 ,探讨非整倍性诱变剂秋水仙素 (colchicine ,COL)对着床前胚胎细胞的影响。方法 :以昆明种小鼠作受试动物 ,分为空白对照、溶剂对照和秋水仙素 (0 .2 5mg/kg、0 .5mg/kg、0 .75mg/kg)处理组共 5个组 ,观察小鼠着床前胚胎丝裂指数和微核率的变化。结果 :① 0 .75mg/kg组的丝裂指数比空白对照显著增高 (P <0 .0 1) ;②微核率随秋水仙素剂量增加而升高 ,呈明显的剂量依赖关系 ,与空白对照组比较 ,差异有统计学显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。结论 :①通过一系列预备试验 ,建立了一种有效地检测化学物非整倍诱变性的动物模型 ;②秋水仙素只有在其剂量达到一定的阈值时才能中止着床前胚胎细胞分裂 ;秋水仙素可诱导着床前胚胎细胞出现非整倍性 ,并呈剂量依赖关系。

不同妊娠方式及女性年龄对流产组织染色体非整倍性的影响

目的 探讨不同妊娠方式及女性年龄与流产组织染色体异常的关系,为辅助生殖技术在遗传学上的安全性问题提供咨询依据。 方法 回顾性分析2014~2018年行早期流产绒毛染色体检查的494例自然妊娠流产样本(自然妊娠流产组)及396例辅助生殖妊娠流产样本(辅助生殖妊娠流产组),将两组患者以35岁为年龄分割界限,又分为<35岁组和≥35岁组。对比染色体异常在两种妊娠方式及不同年龄组中的发生率。 结果 自然妊娠组患者平均年龄及流产孕周显著小于辅助生殖妊娠流产组(P<0.01)。流产组织中,染色体异常样本共计501例,1~22号,X,Y单一染色体异常382例,三倍体异常15例,≥2条染色体异常46例,染色体微缺失/重复58例。染色体出现单一异常的发生率最高,达76.25%。单一发生的染色体异常中,16号染色体异常102例,占26.70%,22号染色体异常及X染色体异常均有54例,发生率均为14.14%。辅助生殖妊娠流产组69,XXN占比(0.86%)显著低于自然妊娠流产组(4.83%)(P<0.01),而21号染色体异常占比(5.60%)显著高于自然妊娠流产组(2.23%)(P<0.05)。辅助生殖妊娠流产组≥35岁流产患者占比显著大于自然妊娠流产组(P<0.001)。不同妊娠方式组内,<35岁患者染色体非整倍性发生率显著低于≥35岁患者(P<0.01)。染色体非整倍性高发类型中:16号染色体异常发生率在<35岁患者中显著高于≥35岁患者(P<0.01);22号染色体异常发生率在≥35岁人群中显著高于<35岁人群(P<0.01);≥35岁患者≥2条染色体异常发生率显著高于<35岁患者(P<0.001),且辅助生殖妊娠流产组显著高于自然妊娠流产组(P<0.01)。 结论 两种妊娠方式流产组织染色体异常的差异可能与ICSI技术相关,也可能与辅助生殖人群年龄相关。辅助生殖技术并没有增加胚胎染色体非整倍性的发生率,而高龄是胚胎染色体非整倍性的诱发因素。

不同妊娠方式及女性年龄对流产组织染色体非整倍性的影响

目的:分析不同妊娠方式及女性年龄对流产组织染色体非整倍性的影响。方法:2017年3月-2019年8月收治早期自然流产患者1000例,按照妊娠方式不同分为两组。A组自然妊娠流产;B组辅助生殖妊娠流产。根据两组患者年龄,分析≤30岁和>30岁与流产组织染色体非整倍性的相关性。结果:B组流产孕周明显高于A组,且B组平均年龄明显大于A组,B组>30岁患者流产比例明显高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。≤30岁患者染色体非整倍性的发生率低于>30岁者,>30岁者22号染色体异常发生率明显高于≤30岁者,≤30岁者16号染色体异常发生率明显高于>30岁者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:在不同妊娠方式中流产组织染色体非整倍性的发生率与患者年龄有相关性,且患者年龄是导致胚胎染色体非整倍性的影响原因。

胚胎形态动力学参数与胚胎整倍性的关系

目的探讨胚胎形态动力学参数与胚胎整倍性之间的关系。方法回顾性分析2016年6月至2019年12月在本中心接受胚胎植入前遗传学检测(PGT)治疗的150名患者的临床资料,共纳入550枚未发生逆分裂、评分在5BC、5CB及以上的可用囊胚。进行滋养层细胞活检后采用单核苷酸多态性(SNP)芯片技术检测胚胎整倍性,并根据囊胚整倍性分为整倍体胚胎组和非整倍体胚胎组。通过时差成像技术(Time-lapse)比较两组14个胚胎早期形态动力学参数[第二极体排出时间(tPB2)、原核出现和消失时间(tPNa和tPNf)、发育至2细胞至8细胞时间(t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8)、第二、三个细胞周期间隔时间(cc2和cc3)、第二、三次细胞分裂同步性指标(s2和s3)]及5个晚期形态动力学参数[开始致密化时间(tC)、形成桑椹胚时间(tM)、形成囊胚时间(tSB)、囊胚孵出时间(tHB)]。结果整倍体胚胎的t4[35.81(34.04,37.86)h vs.36.47(34.14,39.08)h]和s2[0.49(0.25,1.00)h vs.0.50(0.25,1.25)h]均显著小于非整倍体胚胎(P<0.05);tPB2、tPNa、tPNf、t2、t3、t5、t6、t7、t8、cc2、cc3和s3两组间比较均无显著性差异(P>0.05)。整倍体胚胎的tHB显著小于非整倍体胚胎[100.61(96.20,107.56)h vs.103.13(97.47,109.26)h,P<0.05);tC、tM、tSB、(tHB-tSB)两组间比较均无显著性差异(P>0.05)。结论通过Time-lapse系统获取的胚胎早期形态动力学参数t4、s2和晚期形态动力学参数tHB可能成为预测胚胎整倍性的重要指标,在胚胎选择中可以提供一定参考。