十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究

【目的】已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶,初步研究XC1077基因的致病性,为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础。【方法】通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077,用带有全长XC1077基因序列的p LAFRJ质粒对NK1077进行功能互补并检测致病性。【结果】PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功。在MMX基本培养基上,NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致。致病性试验结果表明,NK1077在满身红萝卜的致病性下降到Xcc 8004的48.3%,过敏反应(HR)检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后,而互补菌致病力及过敏反应能恢复至野生型水平。【结论】XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因。

双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能

【目的】通过改造谷氨酸棒杆菌JNR中双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD,减弱尿苷酰去除酶的活性,增强NH4+的转运和利用,提高L-精氨酸的合成。【方法】本文对来源于谷氨酸棒杆菌的突变菌株JNR中的双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD进行整合突变,采用同源重组的方法将H414和D415位点突变为两个丙氨酸AA,在此菌株的基础上过量表达PII蛋白GlnK,并对其进行尿苷酰化研究,离子色谱检测摇瓶发酵过程中NH4+的浓度,并对最终的改造菌株进行连续流加发酵分析。【结果】该双功能尿苷酰转移/去除酶在谷氨酸棒杆菌中成功进行整合突变,有效减弱了尿苷酰去除酶的活性;同时过表达PII蛋白GlnK,其酰基化程度明显增强。摇瓶发酵结果表明菌株L4消耗NH4+增加,L-精氨酸产量为36.2±1.2 g/L,比对照菌株L3高出22.7%。5-L发酵罐实验结果显示改造菌株L4的L-精氨酸的产量为52.2 g/L,较野生型菌株L0提高了25.3%。【结论】谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的过程中氮源是必不可少的。减弱GlnD尿苷酰去除酶的活性后,胞内尿苷酰化的GlnK-UMP增加,GlnK-UMP与氮转录调控因子AmtR结合,转运至胞内的NH4+浓度提高,促使L-精氨酸产量显著提高。

miR-29a靶基因ITGβ_1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ_1基因靶向调控的作用。方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成c DNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ_1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p MIR-Report上,构建出p MIR-ITGβ_1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定。将p MIR-Report Luciferase载体,所构建的p MIR-ITGβ_1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ_1的作用机制。结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建p MIR-ITGβ_1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ_1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达。结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达。