运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种,但其可利用的碳源范围窄.对其进行分子生物学基础研究和基因工程改造的工作早在上世纪八、九十年代就开始了,但基于其独特的生物学特性,至今遗传操作手段仍不成熟.以大肠杆菌(E.coli)pBR328为出发质粒,分段插入带Z.mobilis乳酸脱氢酶基因ldh、分别作为左右同源臂、1.5 kb大小的DNA片段,构建了Z.mobilis定点整合型质粒pBR328-ldhR-ldhL(6 239 bp),此质粒两同源臂片段即ldhR和ldhL的中间有稀有酶切位点NotI和SfiI,以方便插入待整合片段.经NotI位点插入1 216 bp氯霉素抗性基因cml,将相应质粒pBR328-ldhR-cml-ldhL以环型和线型形式分别电击转化Z.mobilis ZM4菌株,都成功筛选到了ZM4 ldh::cml菌株,证明此定点整合质粒是方便可用的,为对Z.mobilis的定点遗传操作提供了很好的基础.

mcr-1阳性类噬菌体质粒与F33:A-:B-质粒共整合形成的融合质粒的生物学特性分析

为了分析猪源大肠杆菌中mcr-1阳性不可接合类噬菌体质粒pD72-mcr-1与bla CTX-M-55阳性可接合的F33∶A-∶B-质粒pD72-F33融合形成的共整合质粒pD72C的生物学特性,评估该融合质粒对mcr-1传播的潜在作用,本实验采用生长曲线测定、质粒稳定性实验、竞争性实验和接合实验,测定了融合质粒pD72C和亲本质粒pD72-F33对宿主菌的适应性、融合能力和扩散能力。结果表明:融合质粒pD72C在无抗生素的环境中能稳定传代9 d,对宿主菌有适应性优势,且比亲本质粒pD72-F33具有更好的竞争优势;该融合质粒表现出较高的融合频率和接合频率,说明该融合质粒能够扩展菌株的耐药谱并促进粘菌素耐药基因mcr-1的传播。

非整合型质粒重编程脐带血CD34^+细胞形成诱导性多潜能干细胞的研究

本研究探索和优化非整合质粒的方法,将人脐带血来源的CD34+(CB CD34+)细胞进行重编程,建立无病毒的iPS技术体系。利用细胞核转染仪将质粒pEB-C5和pEB-Tg转入短暂培养后的CB CD34+细胞中,使其进行重编程形成iPSC,14 d后观察到2×106CB CD34+细胞中约有200个类似ES细胞特征的克隆出现,并对产生的iPSC进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果表明,重编程后的CB CD34+细胞的多能性基因表达与ESC类似,细胞核型正常,外源基因无插入,且具有体内分化成三胚层的全能性。结论:利用非整合型质粒的方法重编程CB CD34+细胞形成iPSC,该方法无外源基因插入、重复性好、操作简单、且效率较高,为建立相对安全的iPSC提供了一个行之有效的途径,为深入探索iPSC应用于临床药物的筛选、组织工程和再生医学研究等提供了很好的研究材料。

lys1-d缺陷型标记介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合

传统构建毕赤酵母质粒多拷贝菌株的方法不仅操作复杂、成本高,而且难以获得理想中的高拷贝菌株.近来,一种利用leu2-d缺陷型标记直接筛选毕赤酵母多拷贝克隆的方法显示出很大的便利.本研究发现,使用一个lys1-d缺陷型标记能更加高效地介导毕赤酵母超高拷贝质粒整合.首先构建一个携带lys1-d和EGFP(enhanced green fluorescent protein)报告基因的整合载体,然后将载体转化至敲除了内源lys1基因的毕赤酵母中,最后分别检测了转化子内EGFP含量和质粒拷贝数.结果显示,所有转化子整合的质粒拷贝数均处于19~168之间;并且转化子内质粒拷贝数越高,其胞内表达的EGFP产量也越高.这一系统为构建毕赤酵母超高拷贝质粒整合菌株增添了有效的工具.

发酵五碳糖和六碳糖产乙醇染色体整合大肠杆菌的构建

为了保证外源基因表达的稳定性,减少发酵副产物的生成,根据同源重组原理,将大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶pfl基因两侧的基因片段作为同源片断,构建了带有运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB的整合重组质粒PA-pfl,用化学法转入大肠杆菌TOP10的感受态细胞,将经过氨苄青霉素筛选得到的重组子进行PCR扩增,证明pdc和adhB基因整合到了大肠杆菌的染色体基因组丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl位点上。乙醇发酵结果表明,重组菌E.coli TOP10-pfl不但能稳定地利用葡萄糖产乙醇,也能稳定地利用木糖产乙醇,在大肠杆菌中建立了一条新的代谢糖生成乙醇的途径。

结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因重组穿梭质粒的构建及其在BCG中的融合与分泌表达研究

通过SOE法(重叠延伸,Genesplicingbyoverlapextension),扩增cfp10-esat6融合基因,与穿梭整合质粒pMV361构建成重组质粒。另将BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列与上述重组质粒构建成另一重组质粒。将两种重组质粒分别导入BCG菌构建融合型重组卡介苗和分泌型重组卡介苗,热诱导后分析其表达产物。本研究成功构建并表达了CFP10-ESAT6融合及分泌表达的重组BCG,为发展新型结核病疫苗打下了一定的基础。

两种非整合载体重编程人脐带血CD34^+细胞形成诱导多能干细胞的研究

目的探索两种非整合载体重编程人脐血来源的CD34^+细胞形成诱导性多能干细胞(iPSCs)的方法。方法利用细胞核转染仪分别将两组非整合质粒转入短暂培养后的脐带血CD34^+细胞中,使其进行重编程形成iPSCs,14d后两种方法均可观察到2×10~6个脐带血CD34^+细胞中约有900个类似ES细胞特征的克隆出现,并对产生的iPSCs进行体内外多能性鉴定及细胞核型检测。结果两种方法重编程效率基本相同,重编程形成的hiPSCs多能性基因OCT4、SOX2、NANOG的表达量与hES细胞系H1比较接近(P>0.05),而与CD34+细胞差别较大(P<0.05),且具有体内分化成三胚层的全能性。结论两种非整合质粒重编程人脐带血来源的CD34^+细胞形成iPSCs的方法,效率基本相同,均无外源基因插入,为建立相对安全的iPSCs提供了有效途径,为临床科研、药物筛选和再生医学研究等提供了较好的方法。

以Zeocin抗性基因为选择标记的Candida glycerinogenes遗传转化

为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeocin抗生素对C.glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C.glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。

海栖热袍菌电转化技术的研究

[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150 V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25 ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。

海栖热袍菌电转化技术的研究(英文)

[目的]对海栖热袍菌电转化技术进行研究。[方法]采用不同参数即不同的方型电脉冲参数、指数衰退型电脉冲参数和高电压电击参数对海栖热袍菌感受态细胞进行电转化,得到的转化子进行PCR验证。[结果]试验中发现以150V的低压方形电脉冲,室温厌氧条件下电击25ms、1次,有利于T.maritima MS8的转化,但这种以整合质粒进行的转化效率极低。[结论]为提高T.maritima MS8的基因转化效率奠定了基础。

丙酮丁醇梭菌代谢工程菌的构建及其发酵性能

丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum可以利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖等多种底物,发酵糖获得丙酮、丁醇、乙醇等产物,是一种优良的木质纤维素同步糖化发酵菌种。为获得具有更优良发酵性能的木质纤维素发酵菌株,使用代谢工程技术对丙酮丁醇梭菌进行改造。将乙酰乙酰CoA硫解酶基因(thl)的启动子和末端两个同源片段以及醛/醇脱氢酶基因(adhE)的开放阅读框连接到pUC18上,构建成整合型质粒pTAEE,电转化丙酮丁醇梭菌后在红霉素抗性平板筛选转化子。通过PCR扩增及产物序列分析表明,质粒pTAEE中的adhE基因以单交换的方式整合到转化子基因组中,增强adhE的表达。重组菌T4的乙醇得率为2.3%,比野生菌提高了15%,乙醇浓度为0.39 g/L,与野生菌相当;丁醇得率为41.6%,比野生菌提高了69%,丁醇浓度为6.9g/L,比野生菌提高了41%,获得了发酵性能更高的丙酮丁醇梭菌代谢工程菌株。

体外培养和遗传育种

910250 马铃薯中产生生物活性的preprothaumatinⅡ[英]/Witty,M.//Biotechnol.Lett.-1990,12(2).-131～136[译自DBA,1990,9(11),90-06293]

酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点。因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键。研究中,从酿酒酵母基因组中扩增得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体p NTS2K中,得到4种复制整合型载体(p NTS2K-ARS304、p NTS2K-ARS315、p NTS2K-ARS735、p NTS2KARS1512)。经电转化后,4种转化子(36a(p NTS2K-ARS304)、36a(p NTS2K-ARS315)、36a(p NTS2K-ARS735)、36a(p NTS2K-ARS1512))都能在含有300μg/m L G418的YPD平板上生长。然而,只有转化子36a(p NTS2KARS315)能在含有500μg/m L G418的YPD液体培养基里较快生长。经过G418耐受性检测后,36a(p NTS2KARS315)仍能在含有1 mg/m L G418的YPD培养基中很好地生长。此外,通过质粒p NTS2K-ARS315表达荧光蛋白,其表达效果高于普通商业质粒。实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制,其中ARS315复制能力最强。因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础。

乳酸菌的基因组编辑技术研究进展

乳球菌(Lactococcus sp.)和乳杆菌(Lactobacillus sp.)是工业上常用的乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB),长期应用于食品和饮料的发酵。近年来,随着分子操作及遗传改造技术的不断完善,推动了乳球菌和乳杆菌的基础和应用研究,其作为功能菌株和工业微生物细胞工厂的重要潜能也不断突显出来。本文综述了工业常用乳酸菌的基因组编辑技术研究进展,着重介绍了基于整合质粒的敲除、敲入,基于基因组重组工程的精细修饰和敲除、敲入,以及基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9[(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease9(Cas9),(CRISPR/Cas9]系统的基因组编辑技术。